苍耳叶提取物与生物抑菌剂对几种常见食品污染菌的体外协同抑菌作用及其作用机理

刘洪霞;韩址楠;姜咏栋;曲艺;李大鹏

【摘要】测定了苍耳叶乙醇提取物和3种生物抑菌剂(ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素和纳他霉素)对6种常见食品污染菌的抑菌效果；分析了苍耳叶乙醇提取物与生物抑菌剂联用时的协同抑菌效果(FICI值).结果表明,联用组对不同菌株表现出协同或者相加抑菌效果,其中苍耳叶乙醇提取物与纳他霉素联用对扩展青霉协同作用显著(FICI=0.375),这种协同作用的机理可能是通过增强菌体细胞膜透性,促进纳他霉素渗透入菌体,增加有效浓度累积,造成细胞膜的破裂,导致菌体死亡.

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【期刊名称】《食品与发酵工业》

【年(卷),期】2013(039)004

【总页数】5页(P17-21)

【关键词】苍耳叶提取物;抑菌;联用;抑制机理

【作者】刘洪霞;韩址楠;姜咏栋;曲艺;李大鹏

【作者单位】山东农业大学,山东泰安,271018;山东农业大学,山东泰安,271018;泰安市环保局监测站,山东泰安,271000;山东农业大学,山东泰安,271018;山东农业大学,山东泰安,271018

【正文语种】中文

我国药用植物资源丰富，其中有近千种对细菌和其他病原微生物具有抑菌作用，其活性成分会自然代谢，参与能量和物质循环，对生态环境较安全，也不会对人类健康造成隐患［1-2］。生物抑菌剂(ε-聚赖氨酸，乳酸链球菌素和纳他霉素等)具有安全无毒的优点，其中ε-聚赖氨酸和乳酸链球菌素还具有一定的保健作用而受到人们的广泛关注［3-4］。抑菌剂的复合使用可以减少单种抑菌剂的添加量，降低成本，弥补单种抑菌剂抑菌谱窄等不足［5-6］，目前，植物提取物与天然抑菌剂联用方面的研究较少。我们前期研究发现苍耳叶乙醇提取物具有较强的抑菌活性。本研究分析了苍耳叶乙醇提取物与ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素和纳他霉素联用对大肠杆菌、扩展青霉等6种常见食品污染菌的抑制效果，初步探讨了协同抑菌机理，为指导这类抑菌剂的合理使用，发现和研制更理想的抑菌剂提供理论依

据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌、藤黄微球菌、扩展青霉，均购自于中国微生物菌种保藏中心;苹果腐烂病菌，由山东农业大学植物保护学院提供;苍耳叶，采集于山东农业大学南校区;纳他霉素，大连英斯特生物技术有限公司;乳酸链球菌素，兰州伟日生物工程公司;ε-聚赖氨酸，南京赛泰斯生物科技有限公司;无水乙醇、蛋白胨、NaCl，牛肉膏等均为分析纯，天津凯通化学试剂有限公司;RPMI1640，MBH，美国Invitrogen 生命技术公司;BCA 蛋白定量测定试剂，北京鼎国昌盛生物技术有限公司;超微量ATP 酶试剂盒，南京建成生物工程研究所。

FW100 高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司;R-3 旋转蒸发仪，瑞士步琪有限公司;LXJ-ⅡB型低速大容量多管离心机，上海安亭科学仪器厂;SYQ-DSX-280A 压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂;SW-CJ-1F 超净工作台，苏净集团有限公司;电热恒温培养箱，上

海跃进医疗器械一厂;FA2104A 电子分析天平，上海精天电子仪器有限公司;QL-901 型旋涡混合器，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司;DDS-307 电导率仪，上海伟业仪器厂;酶标仪，USA，Molecular Devices。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备［7］

苍耳叶经粉碎过筛(50 目)后精密称取10g 用滤纸包实后置入索氏抽提器中，加入150 mL 无水乙醇后抽提6.5 h，连续提取3 次。将收集的浸提液在40℃下真空旋转蒸发器中浓缩，得到膏状植物粗提物，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 最小抑菌浓度( MIC) 的测定［8］

取8 mg/mL 的药液依次2 倍梯度稀释至4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 3、0.015 7、0.007 8 mg/mL，分别设空白对照(只有培养基)和生长对照(菌悬液+ 培养基)，加入0. 1 mL 菌悬液，培养24 h(细菌)，48 h(真菌)后观察，无菌生长的最小浓度即为MIC。

1.2.3 体外联合抑菌能力的判定［9］

故事湖南

根据单药抑菌实验MIC 结果，按棋盘实验法略作修改进行测定。取96 孔聚苯乙烯微孔板，用微量移液器在第1 ～8 列沿X 轴方向(从左到右)每列孔中依次加入:2 MIC ～1/64 MIC(依次2 倍稀释)的抑菌剂A，以同样方法在第A ～F 行沿Y 轴方向(从上到下)每行孔中依次加入2 MIC ～1/64 MIC 的抑菌剂B，然后加入菌悬液，混合均匀，培养24 h(细菌)，48 h(真菌)后观察。部分抑菌浓度分数指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)为协同结果的判断依据，计算方法为:

危险固废FICI =联用时A 的MIC/单用A 的MIC +联用时B 的MIC/单用B 的MIC。FICI ≤0.5，为协同作用;0.5 ＜FICI≤1，为部分协同或相加作用;1 ＜FICI≤2，为无关作用;2 ＜FICI，为拮抗作用。

1.2.4 蛋白质渗漏的测定［10］

采用BCA 蛋白质定量试剂盒测定，将活化后的扩展青霉菌体转接到液体培养基中，28℃条件下培养4 d 后，4 000 r/min 离心5 min，弃上清液，生理盐水洗涤3 次，沉淀用0.1 mol/L pH7. 4 磷酸盐缓冲液稀释为5 ×108 CFU /mL 作为测试菌液。将不同的抑菌剂加入菌悬液中，纳他霉素和苍耳叶乙醇提取物浓度均为各自的MIC，联用浓度为纳他霉素的1/4 MIC +

苍耳叶乙醇提取物的1/8 MIC(下同)，以相同体积的无菌水作对照(下同)，28℃，150 r/min 摇床培养，分别在40、80、120、160、200、240 min 时取出，10 000 r/min 离心5 min，取上清液测蛋白质的含量。

1.2.5 还原糖渗漏的测定［11］

鲽科采用DNS 法，取菌悬液加入不同的抑菌剂，28℃，150 r/m in 摇床培养，分别在40、80、120、160、200、240 min 时取出，10 000 r/min 离心5 min，取上清液测吸光度。

1.2.6 细胞膜通透性的测定［12］

采用电导率法，取菌悬液加入不同的抑菌剂，振荡混匀后，分别测定电导率的本底值A0，然后分别在40、80、120、160、200、240 min 时取出，10 000 r/min 离心5 min，取上清液测电导率A1;然后将上清液倒回离心管中，煮沸20 min，冷却离心后，取上清液测电导率A2。计算不同时段的相对渗透率:

recent文件夹1.2.7 麦角甾醇的测定［13］

准确称取0.30 g 菌体，加入不同的抑菌剂后，28℃培养4 h，收集菌丝，加入PBS(pH7.2)2.5 mL和新鲜配制的皂化剂6 mL(25 g KOH 溶解于35 mL无菌水中，用无水乙醇定容至100 mL)，振荡混匀1 min，85℃水浴60 min 后加入6 mL 石油醚，然后加入6 mL 蒸馏水洗涤，醚层于真空旋转蒸发仪蒸干，得未皂化脂，加无水乙醇至菌液浓度为l g/mL 湿菌。

麦角甾醇和24(28)DHE 在281.5 nm 处都有吸收峰，但是在230 nm 处只有24(28)DHE 有吸收峰，麦角甾醇的百分比含量可以通过总的麦角甾醇和24(28)DHE(通过计算281.5 nm 处的吸收)减去230 nm 处的24(28)DHE 吸收。麦角甾醇的含量计算:

其中，F 是稀释倍数;A1 =麦角甾醇% +24(28)DHE %;A2 = 24(28)DHE %，290 和518 是E 值(每厘米的百分比)。

1.2.8 ATP 酶活力的测定［14］

准确称取0.10 g 菌体，加入不同的抑菌剂28℃培养4 h，收集菌丝，使用Tris-HCl(pH7.5)洗涤2 次，然后放入液氮中10 min 后取出，37℃迅速融化，然后加入25 μL 预冷的Tris-HCl(p

H7.5)，振荡20 s，重复上述操作2 次，使菌体充分破裂，10 000 r/min 离心5 min，取上清液，分别测定Na+ K+-ATPase、Ca+ +Mg+ +-ATPase 活力，测定方法参照超微量ATP 酶测试盒说明书。

2 结果与讨论

2.1 最小抑菌浓度(MIC)的测定

苍耳叶乙醇提取物、ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素和纳他霉素的最小抑菌浓度见表1。可以看出，苍耳叶乙醇提取物对6 种供试菌株均表现出抑制作用。其中对于前4 种供试细菌，苍耳叶乙醇提取物表现出较强的抑制作用，对后两种真菌的抑制作用稍弱;ε-聚赖氨酸对6 种供试菌株也均表现出抑制作用，而乳酸链球菌素仅对3 种革兰氏阳性菌菌株具有抑制作用，纳他霉素仅对两种真菌菌株具有抑制作用。其中ε-聚赖氨酸对枯草芽孢杆菌的抑制效果最好，对大肠杆菌的抑制效果最差;乳酸链球菌素对枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌、藤黄微球菌抑制效果逐渐变差;纳他霉素对两种供试真菌的抑制作用相当。

表1 样品对6 种供试细菌和真菌的最小抑菌浓度 mg/mLTable 1 The MIC of samples on six

tested bacteria and fungus mg/mL供试菌种苍耳叶乙醇提取物ε-聚赖氨酸乳酸链球菌素纳他霉素大肠杆菌0.40.032--枯草芽孢杆菌0.20.0040.064-金黄葡萄球菌0.80.0160.128-藤黄微球菌0.40.0160.256-苹果腐烂菌4.00.016-0.0025扩展青霉4.00.016-0.0025

2.2 体外联合抑菌能力的判定

党外知识分子

苍耳叶乙醇提取物与3 种生物抑菌剂联用后对6 种供试菌株的FICI 值如表2 所示，ε-聚赖氨酸与苍耳叶提取物联用后，对金黄葡萄球菌、藤黄微球菌、苹果腐烂病菌的抑制表现出协同作用，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、扩展青霉的抑制表现出部分协同或相加作用。当乳酸链球菌素与苍耳叶提取物联用后，对枯草芽孢杆菌和金黄葡萄球菌的抑制表现出协同作用，对大肠杆菌、藤黄微球菌、苹果腐烂病菌、扩展青霉的抑制表现出无关作用。苍耳叶乙醇提取物与纳他霉素联用后，对于苹果腐烂病菌、扩展青霉均表现出协同作用，而纳他霉素单独使用时对4 种细菌无抑制作用。

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