作者 l Frank Tao
编辑 l 细胞房间
摘要：随着单克隆抗体技术发展，单克隆CHO细胞株筛选技术也日异月新，越来越高效，越来越智能化。本文主要结合自身CHO细胞株开发和细胞培养经验，将目前国内外单克隆抗体CHO细胞株筛选技术进行总结，供行业内参考，促进行业健康发展；
问题：如何4-6个月内，筛选到稳定的单克隆细胞株表达在3-5 g/L或以上？
金熙俊关键词：单克隆抗体；CHO细胞；ClonePix；单克隆影像学拍照；Beacon；
1.宿主细胞
抗体药物生产的宿主细胞主要NS0、HEK293、Hybridoma、 SP2/0、CHO等，但CHO细胞是生产抗体药物应用最广的宿主细胞，CHO细胞类型也比较多，例如：DG44、DXB11、CHO K1、CHO-S等。上世纪八九十年代开始，工业上使用较早的是DHFR体系（二氢叶酸
还原酶缺陷型）DG44细胞。当细胞培养基内还有MTX（甲氨蝶呤）时，二氢叶酸还原酶被抑制，通过反馈调节，使得该基因自我扩增，连带齐上下100-1000kb的基因都会扩增，如此目的基因也得到扩增，即可以提高目的蛋白的表达量。现在很多单抗生产的体系依然是DG44。 GS体系（谷氨酰胺合成酶）CHO-K1是近些年发展的一种基因扩增筛选系统，较DHFR系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛地认可。其原理是GS在ATP水解提供能量的同时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏外源的谷氨酰胺培养基中加入GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵（MSX），可使GS基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。该系统的优点主要在：该系统不需要基因缺陷型的CHO-K1细胞株做为宿主细胞；CHO-K1细胞易于培养，更强壮；在培养基中无需加谷氨酰胺，能够避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，并且可有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。
当然，目前也有商业化的GS缺陷性CHO细胞，主要有lonza公司的CHOK1SV（2002年）和CHOK1SVGS-KO（2012年），Merk公司（原SAFC）的CHOZN CHO K1（2006年），
被折磨的男孩采用缺陷的GS体系筛选可以缩短单克隆筛选周期，但由于供应商收费昂贵，国内外很多公司依然选择ATCC原始的CHO K1宿主细胞。
2.筛选标记以及表达载体选择
表-1 哺乳动物细胞表达载体中常用的筛选标记
Table-1 Selectable markers often used in mammalian expression
| 筛选标记 | 筛选试剂 国民党五大主力 |
代谢型筛选标记（扩增型基因筛选标记） | 二氢叶酸还原酶（DHFR） | 甲氨蝶呤（MTX） |
谷氨酰胺合成酶（GS） | 氨基亚砜蛋氨酸（MSX） |
抗生素筛选标记（非扩增型基因筛选标记） | 嘌呤霉素抗性（Puromycin acetyltransferase） | 嘌呤霉素（Puromycin） |
杀稻瘟霉素脱氨酶（Blasticidin deaminase ） | 杀稻瘟霉素（Blasticidin ） |
组氨醇脱氢酶（Histidinol dehydrogenase） | 组氨醇（Histidinol） |
潮霉素磷酸转移酶（Hygromycin phosphotransferase） | 潮霉素（Hygromycin） |
氯林可霉素耐药基因（Zeocin resistance gene） | 氯林可霉素（Zeocin） |
博来霉素耐药基因（Bleomycin resistance gene） | 博莱霉素（Bleomycin） |
氨基糖苷磷酸转移酶（Aminoglycoside phosphotransferase） | 新霉素（Neomycin or G418） |
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以上表格是统计了目前哺乳动物细胞表达载体中常用的筛选标记，随着GS体系优越性，越来越多的公司选择采用GS筛选标记。
商业中所选择Vector供应商主要是Life technologies公司的，从pcDNA3系列到现在Freedom pCHO1.0，其大小由原来的4000-5000kp到现在的近13000kp。Freedom pCHO1.0是Life technologies在2012年开发的一个vector，大小有12988bp（见下图），具有以下特点：(1)目的基因的轻链和重链可以同时插入一个vector上面，以前的vector设计多数是插入一个轻链或者重链；（2）它在可插入的轻链或者重链的前面设计的启动子在CMV基础上分别进行较大的改善；（3）它具有两个筛选标记，以前的vector仅仅设计了一个筛选标记。
图-1 Freedom pCHO1.0图谱
Figure-1 Freedom pCHO1.0 profile
由于vector是细胞株筛选非常关键的一个环节，很多公司具有自主知识产权的vector，当然在密码子、启动子等元件会做很多优化和工作，最终得到一个高表达的vector。
同时，在信号肽选择方面，也是非常关键，通常很多公司会采取现有应用于单克隆抗体药物信号肽专利，将几个专利中的信号肽进行初步筛选适合于自己项目的信号肽。也有大型公司开发属于自主知识产权的信号肽。
3.转染方法大功率半导体激光器
常用于哺乳动物细胞转染方法：磷酸钙法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法和电穿孔法，在工业界使用最多的应该电穿孔法，它是通过物理电流细胞膜形成瞬时孔洞，DNA沿孔洞进入细胞，随机整合细胞染体。
另外，随着技术的发展，也有定点整合技术，即DNA直接定点整合到CHO细胞染体某一位点，但由于技术成熟度以及项目的差异性，还未在工业界广泛推广使用。
4.单克隆筛选技术
CHO细胞转染之后，通常会加压一段时间做一个clone pool或者minipool，然后进行单克隆筛选。结合笔者经验，主要简单介绍Puromycin、G418、MTX以及MSX等筛选压力原理及浓度范围。
筛选标记 | 原理 |
Puromycin | 它为氨基糖甙类抗生素，通过干扰核糖体功能阻断哺乳动物细胞的蛋白质合成，来自链霉菌的pac基因具有解除puromycin毒性的作用。 |
G418 | CO2封存 它是一种氨基糖苷类抗生素，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂之一。 |
MTX | 它为叶酸拮抗剂，在细胞内经过转换后可抑制 DHFR的活性，抑制核酸合成，引起细胞毒性。文献报道称，随着MTX浓度的增加，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，DHFR基因得以扩增，目的基因拷贝数随着增加，提高表达量。 |
MSX | 它为谷氨酰胺合成酶基因GS系统压力。谷氨酰胺合成酶（GS）扩增系统是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效应。 |
| 联合早报电子版 |
筛选标记 | Puromycin | G418 | MTX | MSX |
浓度范围 | 10ug/ml-50ug/ml | 200ug/ml-700ug/ml | 25nM-1000nM | 25uM-500uM |
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哺乳动物细胞筛选稳定的细胞株常用的方法主要有以下几种：96-孔或384-孔单克隆有限稀释法，流式细胞仪法，Clone Pix system筛选法，Beacon单细胞光导系统筛选法等。
根据ICH Q5D以及FDA、EMA/CHMP 等指南，对于单克隆源性越来越重视，所以在单克隆筛选的时候，很多公司会进行单克隆影像学拍照，即在克隆形成的时候证明克隆确定是由单个细胞形成而来，对于IND申报材料对于单克隆源性更有说服力。对于单克隆影像学拍照仪器主要有：MolecularDevices公司的CSI（Cell SelectImager）仪器、Solentim公司的CellMetric或Cell Metric CLD。
很多大型公司通常采用以下组合形式筛选单克隆，确保为单个细胞形成单克隆：
| 筛选方式 |
1 | 传统方法：两轮有限稀释法（小于0.5 cell/well） |
2 | 一轮有限稀释法（小于0.5 cell/well）同时影像学拍照证明单克隆 |
3 | 流式细胞仪法同时影像学拍照证明单克隆 |
4 | 流式细胞仪法，加一轮有限稀释法（小于0.5 cell/well） |
5 | 两轮ClonePix system筛选 |
6 | 一轮ClonePix system筛选，加一轮有限稀释法（小于0.5 cell/well） |
7 | Beacon单细胞光导系统筛选法 |
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其中第7点单克隆筛选方法，是最近一两年出来新筛选仪器方法，是美国BERKELEY LIGHTS公司研发的一款集抗体研发和细胞株开发一体的仪器，有很多大型公司正在采用这一新技术进高效抗体研发和细胞株开发。
5.单克隆筛选评价
总结来看，个人认为筛选克隆一般遵循以下几点：
（1）克隆产率高低。在早期筛选克隆时候，我们最关注的是titer的高低，同时Qp（Cellspecific productivity，单位时间单个细胞所表达的抗体量）也需要关注，工业上所用的克隆Qp一般在20-100pg/cell/day。
在孔板期间titer的检测一般通过Elisa法或者HTRF（Homogeneous Time Resolved fluorescence）均相时间分辨荧光技术的简称）方法，后者是目前高通量筛选克隆常用的检测方法。HTRF技术室对TR-FRET技术的进一步改良，提供了更高的灵敏度和稳定性，为法国Cisbio Bioassays公司的专利技术。它是一种竞争结合分析的方法，而Elisa是亲和结合分析的方法。最近又有一种新的微量检测方法：ForteBio Octet分析方法，它的基本原
理是微量的protein A的原理，与Elisa相比，Octet平台自动化程度高，测定的速度快，更贴近摇瓶和反应器种细胞表达量测定的方法，但其费用可能偏高，暂时没有得到广泛地应用到测定孔板titer。
（2）克隆生长状态。一般在工业上CHO细胞的翻倍时间一般15-24小时，在批次培养或者流加培养的时候，平台期能够尽量长些。
（3）克隆稳定性。筛选的克隆到达摇瓶之后，建立RCB之后，应该尽快做稳定性试验，考虑克隆的稳定性，一般会考察到60代。稳定性包括：（a）生长稳定性即翻倍时间的稳定性；（b）表达稳定性即titer或者Qp的稳定性；（c）遗传稳定性。
（4）抗体质量考察。早期克隆筛选的时候，一般会考察：（a）cDNA序列的鉴定、肽图分析、CE-SDS，分子完整性质谱等，主要避免抗体氨基酸序列突变或丢失的克隆，确定蛋白分子正确性；（b）SEC分析，避免容易形成多聚体的克隆；（c）糖型分析，有的单抗中糖基化对活性非常敏感，避免一些糖型较差的克隆；（d）IEF或者iCIEF，离子交换谱HPLC分析法，避免一些产生高酸或高碱变体克隆等。还有其项目蛋白本身属性关键质量进行分析，提前了解候选克隆特性。
（5）前面的四点可以在摇瓶中进行，但在选定一定数量的克隆需要进入反应器进行评价，主要是考察生长、表达和质量等。
参考文献
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