梅文枫;朱一平;尹帮旗;许晓刚;方树彬
【摘 要】目的 筛选高表达抗PD-1抗体的工程细胞株和较优的基础及补料培养基,并进行代谢分析. 方法 分别在TPP摇管、摇瓶中通过流加培养的方式,从6株细胞株和5种商业培养基中筛选高表达抗PD-1抗体的GS-CHO细胞株和较优的基础及补料培养基.在流加培养过程中,检测葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸及氨等的浓度变化.同时为分析限制性营养因素,进一步对乳酸、氨及氨基酸代谢进行分析. 结果 通过TPP摇管初步筛选,显示122和126两株细胞在HyCellCHO培养基中表现最好,表达量分别为1.945和1.989 g/L;在摇瓶中进一步验证显示122细胞在6株细胞中的最大活细胞密度图最高,达2.21×107 cells/mL,表达量＞2 g/L.代谢分析发现,乳酸代谢切换和谷氨酸及丙氨酸代谢相关.氨基酸分析发现,蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等必需氨基酸可能为122细胞株生长和(或)表达限制性成分. 结论 筛选出高表达抗PD-1抗体的细胞株和较优培养基,同时代谢分析和氨基酸分析为后续细胞培养工艺开发及个性化培养基优化提供理性指导. 【期刊名称】《福建医科大学学报》
【年(卷),期】2018(052)005
【总页数】8页(P320-327)
【关键词】GS-CHO细胞;培养基;细胞计数;代谢
【作 者】梅文枫;朱一平;尹帮旗;许晓刚;方树彬
【作者单位】福建医科大学 免疫研究所,福州350122;福建医科大学 免疫研究所,福州350122;福建医科大学 免疫研究所,福州350122;福建医科大学 免疫研究所,福州350122;福建医科大学 免疫研究所,福州350122
【正文语种】中 文
【中图分类】R329.24;R341;R977.6
程序性死亡蛋白1(programmed death 1，PD-1)信号通路成为肿瘤免疫的热点之一，肿瘤细胞表面的程序性死亡配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)通过与PD-1的结合抑制了肿瘤特异性CD8+T细胞的免疫活性，介导了免疫逃逸，抗PD-1/抗PD-L1抗体通过阻
断负性免疫调节信号，阻断免疫逃逸而杀伤肿瘤[1]。目前国际上已有5个抗PD-1/PD-L1抗体药物获批上市，开发此类药物具有广阔前景。
工程中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary，CHO)由于能进行正确的翻译后修饰，如蛋白折叠、糖基化，且重组蛋白分泌至胞外便于纯化，已成为抗体药物首选表达宿主[2-3]。为建立高表达、稳定、质量可控的重组CHO细胞株及培养工艺，前人已进行了大量的工作，包括从营养底物优化[4-7]、代谢工程[8-10]、过表达抗凋亡基因[11-12]、信号转导[13]等方面改善CHO细胞表现。
方仓医院为建立高产稳定的细胞培养工艺，有必要进行氨基酸代谢分析，其将有助于确定营养限制性成分。本研究在前期培养基筛选基础上，在5种商业培养基中流加培养6株表达抗PD-1抗体的GS-CHO细胞，并进行代谢分析，有助于深入理解GS-CHO的代谢和营养需求，对后续细胞培养工艺及个性化培养基的开发优化提供理性指导。
1 材料与方法
1.1 材料
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1.1.1 细胞株 实验所用宿主细胞为LONZA公司的GS基因敲除的CHOK1SV GS-KO(GS-CHO)，表达抗人PD-1抗体的重组GS-CHO细胞株由实验室自行构建，抗体重链、轻链表达质粒转染宿主细胞，经有限稀释法得到6株表达量较高的不同单克隆，分别命名为121，122，123，125，126，129。
1.1.2 试剂 Cellvento CHO-210 Chemically Defined Medium(批号:F1875785510)，Cellvento Feed-210 Chemically Defined Feed(批号:F1876188515)均购自德国Merck Millipore公司；CD011无血清培养基(批号:150415400PM)，CD Feed 002补料培养基(批号:150320400PM)均购自中国甘肃健顺生物科技有限公司；HyCloneHyCell CHO liquid medium(批号:AAM209018)，Cell Boost 7a Supplement(批号:ABA212153D)和Cell Boost 7b Supplement(批号:AAK210346C)均购自美国Hyclone公司；PowerCHO-Advance(批号:507440)，CHO Xtreme Feed(批号:5SS073)均购自瑞士Lonza公司；Dynamis AGT Medium(批号:1805223)，EfficientFeed C+ AGT Supplement(批号:1805218)，CD CHO Medium(批号:1805218)均购自美国Thermo Scientific公司；AccQ Tag化学组件包(批号:8218860431，美国Waters公司)。
1.1.3 仪器 超高效液相谱仪(UPLC H-class bio system，美国Waters公司)；CO2培养箱(Forma 371型，美国Thermo Scientific公司)；自动细胞计数仪(TC-20，美国Bio-Rad公司)；自动生化分析仪(BioProfile 400，美国Nova Biomedical公司)。
2014浙江高考英语1.2 方法
1.2.1 细胞复苏、传代 取在5种培养基中已完成驯化的冻存细胞置于37 ℃水浴中快速融解，加入新鲜培养基离心去上清(200×g)，细胞重悬于含25 μmol/L蛋氨酸亚氨基代砜的传代培养基中摇瓶悬浮培养，培养条件：37 ℃，体积分数为0.05的CO2培养箱，135 r/min，19 mm振幅。培养3～5 d后细胞密度达到3×106～5×106 cells/mL传代。
1.2.2 TPP摇管批次培养及流加培养 取处于对数生长期的种子细胞，按5×105 cells/mL接种密度接种于5种培养基中，置于50 mL TPP摇管中培养，总培养体积30 mL，初始体积视不同培养基组为总体积的60%～80%，每组设置3个平行。培养条件：37 ℃，体积分数为0.05的CO2培养箱，300 r/min，19 mm振幅。取样测定初始营养物浓度，计为Day0。从Day3或Day4开始根据相应的补料方案进行间隔补料，残糖浓度低于2 g/L时加入一定量的300 g/L葡萄糖溶液使残糖浓度维持在1～2 g/L。每24 h取样测定细胞密度及活率，上清留
样于-20 ℃保存，实验结束后统一测定抗体浓度。流加培养持续14 d，细胞活率低于80%时结束培养。
1.2.3 摇瓶流加培养 根据TPP摇管流加培养的情况，优选出2种培养基在250 mL Erlenmeyer摇瓶中流加培养。CHO细胞接种条件与TPP摇管培养一致，总培养体积60 mL，初始体积视不同培养基组为总体积的60%～80%，每组设置3个平行。培养条件：37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱，135 r/min，19 mm振幅。取样方式及流加培养的补料策略与TPP摇管培养相同，生化分析仪测定培养上清中代谢物浓度(葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸、氨等)，留样样品于-20 ℃保存。
1.2.4 活细胞密度(viable cell density，VCD)及活率测定 采用台盼蓝拒染法，细胞悬液与等体积0.4%台盼蓝溶液混匀后注入细胞计数板上的测量腔室，自动细胞计数仪计数VCD及总细胞密度，并计算活率。
1.2.5 抗体表达量测定 使用Waters的超高效液相谱仪(ultra performance liquid chromatography，UPLC)，采用Applied Biosystem的PA ImmunoDetection Sensor Cartridge(2.1 mm×30 mm，20 μm)谱柱测定抗体表达量，谱条件如下：柱温30 ℃，
治理结构检测波长280 nm，进样体积10 μL，先用10 mmol/L PBS(含150 mmol/L NaCl，pH 7.2)的流动相A平衡谱柱4 min，再用150 mmol/L NaCl(醋酸调节pH至2.6)的流动相B洗脱谱柱4 min，最后再用流动相A重新平衡谱柱2 min，流速0.5 mL/min。根据自制抗体标准品所作的标准曲线计算样品浓度。
1.2.6 氨基酸浓度测定 采用柱前衍生法，样品20倍稀释后用Waters AccQ Tag化学组件包中的AccQ Fluor衍生剂6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate，AQC)衍生样品中的游离氨基酸，衍生操作按AccQ Tag说明书进行。定量分析采用Waters UPLC，FLR检测器，Waters AccQ Tag Ultra氨基酸分析柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。谱条件如下：进样量1 μL，流动相A为AccQ Tag流动相稀释液，B为乙腈，荧光检测器激发波长250 nm，发射波长395 nm，平衡谱柱15 min，25/25/25/25 ABCD流速设定0.7 mL/min，使用组件包中的氨基酸水解标样进行外标定量。
1.2.7 计算公式 积分活细胞密度(integral viable cell density，IVCD)，其中t为时间(d)，Xvt为时间t时的活细胞密度，使用梯形法则计算：
简述组织结构的特征IVCD=Xvtdt
产物比生成速率(specific production rate，qp)，P为产物:
底物比消耗速率(specific consumption rate，qs)，S为底物:
得率系数Y为产物生成(mol)与底物消耗(mol)之比:
1.3 统计学处理 数据以表示，采用GraphPad Prism 5进行统计学分析，采用单因素ANOVA进行显著性检验，P<0.05为差别具有统计学意义。
2 结 果
2.1 高表达细胞株及流加培养基的初步筛选 在50 mL TPP摇管培养中，6株细胞株分别在5种培养基组合(基础培养基+补料培养基)中流加培养，其中PowerCHO Advance组和CD011组细胞生长状态不佳，较早于Day8结束实验，其余3种培养基活率维持较好，于Day14～Day17结束实验(图1)。6株细胞均在HyCell CHO培养基中生长情况最好，最大活细胞密度(peak viability cell density，PVCD)及IVCD较其他培养基高，其次为Dynamis培养基，122
朱生豪细胞在5种培养基中的生长曲线见图2。对于HyCell CHO和Dynamis培养基，6株细胞的Titer和qp各组间差别均有统计学意义(P<0.05)，其中122和126细胞在HyCell CHO培养基中表现最好，表达量分别为1.945和1.989 g/L(表1)。
PVCD：最大活细胞密度； IVCD：积分活细胞密度. A:PVCD图; B:IVCD图.图1 6株细胞在5种培养基中的PVCD和IVCDFig 1 PVCD and IVCD with cell line and medium combinations
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