宿主细胞与重组蛋⽩⽣产
动物细胞是⽣产性重组蛋⽩的强有⼒⼯具。为与⼩分⼦药物区别开来，性蛋⽩、疫苗以及细胞产品统称为⽣物制品。宿主细胞的选择和改造对于提⾼产品的产量和质量来说⾄关重要。因此必须对细胞进⾏筛选，选出具有⾼表达量和良好⽣长特性的细胞。在此我们主要讨论适⽤于⼤规模⽣产重组蛋⽩的细胞株的筛选。 咨询业务
⼯业上重组蛋⽩的制备主要有两种⽅式：瞬时转染和稳定转染。瞬时转染经常⽤于制备少量蛋⽩（多达克级）⽤于药物开发早期的蛋⽩活性或动物实验。瞬时转染并不产⽣克隆细胞株，它只是暂时将编码外源蛋⽩的质粒转导⼊已有的细胞株⾥⾯（⽐如HEK293或COS细胞）。随着细胞的分裂外源基因不断丢失，蛋⽩产量较低，⼀般在1-100mg/L。近年来有报道称HEK293细胞中瞬时表达产量可达1g/L。 与瞬时转染不同，稳定细胞株是为⼯业化⽣产性蛋⽩⽽构建的。稳定细胞株需要具备在不同的时间，不同的场地以及不同的批次间⽣产相同质量产品的能⼒。在选定⽣产⽤细胞株之后，需要建⽴主细胞库（mater cell bank）。从主细胞库复苏后，扩增建⽴⼯作细胞库（working cell bank），⼯作细胞库⽤于⽣产。细胞库通常保存在液氮中，需要维持整个产品的⽣命周期。在构建⽣产⽤细胞株的过程中，宿主细胞和表达载体⾄关重要。 费尔马点>西北大学学报
稳定细胞株构建---⾼产细胞株的秘密
CHO和⾻髓瘤细胞是构建稳定细胞株最常⽤的两种宿主细胞。基本上⽤这两类细胞⽣产的性蛋⽩都能分泌到细胞外，从⽽可以从细胞培养液中收获产物。CHO细胞属于成纤维细胞，是⼀种⾮分泌型细胞，它本⾝很少分泌内源蛋⽩。
科研⼈员在蛋⽩组学和转录组学⽔平上研究了B细胞变成浆细胞所发⽣的⽣理变化。细胞转变提⾼了能量代谢⽔平，改善了蛋⽩分泌和糖基化能⼒，同时增加了氧化还原⽔平⽤来应对活性氧的影响。B细胞或浆细胞的基因组中只有⼀个功能性的免疫球蛋⽩基因。在B细胞成熟的过程中，⼆倍体细胞中其中⼀个等位基因发⽣失活。但是，仅仅是免疫球蛋⽩基因的⼀个拷贝⾜以使浆细胞成为⼀个⾼产的分泌细胞。因此，只需将⽬的基因的⼀个拷贝整合到杂交瘤细胞基因组适合的位置就可以使其成为分泌外源蛋⽩的强⼤细胞。与瘤细胞不同，CHO必须经过改造后才能提升蛋⽩表达能⼒。除了蛋⽩表达能⼒之外，优秀的细胞株还应具备良好的⽣长和代谢特性。在过去的⼗多年⾥，⼤量转录组学和蛋⽩组学的研究致⼒于揭⽰⾼产细胞株的特性。⼈们逐渐意识到没有那⼀种主要的调控因素能使CHO或NS0来源的重组细胞变成⾼产细胞株。⾼产细胞株的形成涉及细胞内许多通路的改变，⽐如代谢、分泌、氧化还原平衡和⽣长/死亡调控；更可能的是⼤量基因表达⽔平的微⼩变化，⽽不是⼏个主要节点的⼤变化。
构建⾼产细胞株的基本步骤
•转染-筛选-扩增-单克隆化-筛选-驯化
⾸先，通过质粒将⽬的蛋⽩的编码基因导⼊到细胞内。质粒上除了⽬的基因外还带有抗性基因，⽐如抗⽣素抗性基因。这样在转染后就可以利⽤选择压⼒富集整合质粒的细胞。在哺乳动物细胞中质粒不能进⾏复制，未整合到基因组中的质粒随着细胞分裂逐渐丢失。在⼀段时间的选择压⼒后，所有存活下来的细胞基因组中都整合了外源质粒。
获得了⼀系列整合了外源基因的稳定细胞后，接下来就需要从中筛选出表达量最⾼的克隆。最常⽤的⽅法是检测96孔细胞培养板中蛋⽩的浓度；另外⼀个⽅法是让细胞在软琼脂上⽣长形成集落，然后利⽤原位免疫沉淀技术获得⾼产细胞。近年来，发展起来的⾼通量⾃动化筛选技术也被受关注。
为实现克隆的⾼表达，在有些情况下外源基因扩增，⽐如以CHO⽤作宿主细胞；有些情况则不需要，⽐如杂交瘤细胞。为了实现外源基因的扩增，将细胞在⾼浓度的扩增标记（⽐如dhfr）抑制剂的压⼒下⽣长。细胞存活需要扩增标记。⾼浓度的抑制剂能够杀死除拥有多个扩增标记基因以外的绝⼤多数细胞。在标记基因扩增的过程中，与它相邻的基因也随之发⽣扩增。基因拷贝数的增加导致转录和翻译⽔平的提⾼。在这个过程中，某些⾼产细胞株重组IgG重链的转录⽔平成为细胞内最⾼。另⼀⽅⾯，过⾼的蛋⽩表达可能会超过细胞内蛋⽩折叠的限度，内质⽹中发⽣未折叠蛋⽩效应导致细胞凋亡。因此没有建⽴起与⾼表达相匹配的其它结构的细胞可能不能存活。
基因扩增后的细胞既含有多个拷贝的外源基因，能⾼⽔平的表达⽬的基因和抗性基因，还具备了强⼤的蛋⽩分泌能⼒。
基因扩增后的细胞既含有多个拷贝的外源基因，能⾼⽔平的表达⽬的基因和抗性基因，还具备了强⼤的蛋⽩分泌能⼒。除此之外，⾼产细胞株还应具备⾼密度培养和能维持较长平台期的能⼒。
基因扩增后的细胞可以视为⼀个细胞“Pool”，其中含有众多不同遗传背景的细胞，或是基因插⼊位点的不同，或是扩增程度的不同等等。因此基因扩增后下⼀步是细胞的单克隆化。单克隆化是利⽤流式细胞仪或有限稀释法或其他⾃动化⽅式(0.2个细胞/孔)将细胞接种到多孔板中。可以认为从某⼀特定孔⾥长出的细胞都是由早期的⼀个细胞分裂⽽来，他们在遗传上是同源的。
江阴城南小学单克隆化后需要对获得的细胞株进⾏初步的评价。主要包括⽣长特性，产品质量的评价。有些情况下需要将细胞驯化到更接近⽣产模式的条件下，进⾏培养。
单克隆化细胞株构建过程中的关机环节。通常不管是否进⾏基因扩增都应进⾏细胞的单克隆化。尽管⽤于构建细胞株的宿主细胞都是⾮整倍体，倾向于进⾏基因组重排和表观遗传学的改变；但是单克隆化获得的细胞在同源性上远⾼于细
胞“Pool”。从单个细胞开始到⽣产环节结束，细胞⼤概需要进⾏60次分裂；如果算上整个产品的市场
寿命，细胞⾄少需要80次分裂。通过单克隆化可以防⽌最初细胞“Pool”⾥发⽣突变或产量低细胞成为优势体，逐渐取代⾼产细胞，导致细胞不稳定。
蓝血人作品转染⽅法
•通常使⽤的转染⽅法主要有DNA-磷酸钙共沉淀法，电击法，脂质体法。
质粒DNA的基本元件
外源基因是以质粒DNA的形式进⼊动物细胞的，同时质粒DNA上带有提⾼外源基因转录和翻译⽔平的元件。尽管病毒来源的载体和细菌来源的载体都被⽤来将外源基因导⼊动物细胞，但是⼯业上在构建细胞株的过程中极少⽤到病毒来源的载体。
⽬的基因可以由组成型，诱导型或条件型启动⼦进⾏启动转录。在细胞分化和发育的研究中经常⽤到条件型启动⼦，它可以由某些特定因素引发，导致蛋⽩表达，影响细胞的分化。但是在重组蛋⽩的⽣产中，绝⼤多数表达载体使⽤强组成型的的启动⼦。通常病毒来源的启动⼦，如SV40晚期启动⼦和CMV启动⼦，应⽤最为⼴泛。近年来，CHO来源的EF-1和GAPDH的启动⼦也被应⽤到蛋⽩⽣产中。
为了提⾼转录⽔平，除了使⽤强的启动⼦外，还可以在⽬的基因中插⼊内含⼦。通常可以看到在⽬的蛋⽩的基因中含有⾄少⼀个内含⼦。此外，密码⼦优化可以提⾼基因的翻译⽔平。表达载体除了包含
启动⼦、增强⼦和⽬的基因外，还需要有筛选标记基因，甚⾄，扩增标记基因。
尽管转染后有⼤量的质粒进⼊细胞，但是只有极少数能够进⼊细胞核，进⼀步整合到基因组中。细胞中只有整合的质粒才能复制，未整合的质粒逐渐被降级或丢失。转染后⾄少有⼀个筛选标记基因（抗性基因）整合到基因组并成功表达的细胞在抗性的压⼒下才能存活。
筛选标记可以分为显性的和隐形的。隐形筛选标记是细胞内固有的基因，缺失时影响细胞⽣长（如DHFR）。通过引⼊外源补偿基因可以克服这类缺陷。⽐如，CHO DG44 细胞是DHFR基因双敲除的细胞株，需要在培养基中添加HT才能正常⽣长。通过转染使其获得功能性的DHFR基因，就能使它在不含HT的培养基中也能⽣长。相反，显性筛选标记（⼀般为抗⽣素）对细胞具有杀伤作⽤。通过向细胞中引⼊抗性基因可以赋予细胞对抗显性筛选标记的能⼒。每⼀个抗性基因编码⼀种酶，可以破坏显性筛选标记的化学结构。下表（table2）中显⽰的是常⽤的显性筛选标记和抗性基因等信息。
参与使抗⽣素失活的酶（由抗性基因表达）只有在细胞内才有活性，失活过程中的磷酸化和⼄酰化反应需要ATP和⼄酰基团等底物，因此抗⽣素的失活必须在细胞内部才能进⾏。另⼀⽅⾯，蛋⽩酶即使在细胞死后释放到培养基中仍有活性。因此，在细胞株筛选过程中，筛选试剂（如抗⽣素）的浓度随时间逐渐降低，降低的速率取决于转染后细胞的密度。所以，最优的筛选试剂浓度不⽌取决于细胞系，也取决于细胞的密度。单克隆筛选和细胞体“Pool”筛选在抗性浓度的使⽤上可能⼤不相同。
扩增
哺乳动物细胞中最常⽤的两种基因扩增系统是：⼆氢叶酸还原酶（DHFR）和⾕氨酰胺合成酶（GS）系统。DHFR是催化⼆氢叶酸还原成四氢叶酸的酶，四氢叶酸是⽢氨酸、胸苷⼀磷酸和嘌呤⽣物合成所必需的。氨甲喋呤（MTX）是叶酸
化⼆氢叶酸还原成四氢叶酸的酶，四氢叶酸是⽢氨酸、胸苷⼀磷酸和嘌呤⽣物合成所必需的。氨甲喋呤（MTX）是叶酸的类似物，可以与DHFR结合并抑制其活性。从⽽使细胞在缺乏胸苷和嘌呤的培养基中死亡。
当细胞在MTX的压⼒下⽣长时，只有DHFR基因扩增并⾼效表达的体才能存活下来。DHFR基因扩增可以带动插⼊位点附近10-10,000kb的DNA序列⼀起扩增。因此与DHFR邻近的外源基因也随之扩增。
扩增可以使⼀步完成也可以是分⼏步完成。随着MTX浓度的升⾼，存活下来的细胞DHFR扩增程度越⾼。能耐受⾼浓度MTX压⼒的细胞，可能含有⼏千个拷贝的DHFR基因。
GS筛选系统基于细胞中的⾕氨酰胺合成酶可以利⽤⾕氨酸和氨合成⾕氨酰胺。绝⼤多数哺乳动物细胞内源的⾕氨酰胺合成酶活性很低，需要在培养基中额外添加⾕氨酰胺细胞才能⽣长。GS筛选系统的载
体含有⾕氨酰胺合成酶和外源基因，因此可以在不含⾕氨酰胺的培养基中进⾏筛选。通常⽤⽐较弱的启动⼦，如SV40启动⼦来启动GS基因。在⾼浓度的⾕氨酰胺合成酶抑制剂（MSX）的作⽤下，可以筛选得到基因⾼度扩增的细胞。
为实现外源基因的⾼效表达，基于上述筛选系统⼈们开发出了更为复杂有效的筛选途径。⽐如把DHFR与G418抗性基因相连，转染后加G418压⼒，这时只有质粒载体整合到转录活跃区的细胞才能表达⾜够⾼的潮霉素抗性，抵抗G418的压⼒从⽽存活下来。这时筛选出的克隆只含有外源基因的少数⼏个拷贝。接着通过MTX的扩增作⽤，使整合基因在细胞基因组中进⼀步扩增，从⽽实现外源基因的⾼表达。
通过为期⼀到两周的基因扩增过程，筛选试剂浓度相应降低。在较低的筛选压⼒下，外源基因的拷贝数可能减少，导致转录⽔平和蛋⽩产量的下降。拷贝数的丢失与外源基因整合到染⾊体上的位置有关，位于染⾊体两臂末端的基因更倾向于丢失。通常在降低筛选压⼒后，细胞株先是经历⼀个外源基因拷贝数和表达量迅速下降的过程，随后便趋向于稳定。所以，通常需要维持⼀个合适的选择压⼒来防⽌细胞不利突变的发⽣，影响拷贝数或引起细胞⽣长速率的变化。
细胞驯化
确定⽣产⽤细胞株后，需要尽快使其适⽤⽣产规模下的培养条件。
马斯洛
细胞株稳定性研究
•从细胞复苏（2×108个细胞）到⽣产（20m3）细胞⾄少需要分裂16次；
•稳定性试验⾄少测试细胞分裂40次；
•⽤于疫苗⽣产⽤的正常的⼆倍体细胞通常在⼀定的分裂次数内保持稳定
•连续培养的细胞系的核型不断变化。
体外培养的细胞发⽣基因突变和表观遗传学改变的⼏率很⾼。这有可能是受培养条件的影响。⽐如，⼀些类型的⼲细胞在细胞密度、氧⽓浓度和⽣长因⼦浓度等条件发⽣改变时会发⽣分化。⽤于疫苗⽣产的细胞多数是⼆倍体，在既定的培养条件下相对稳定。在⽣产上能接受的倍增次数范围内，这类细胞不会出现可见的表型或染⾊体上的变化，因此⽣物⽣产⼯艺上对这类细胞的稳定性关注较少。
•细胞株稳定性涉及：
•⽣产能⼒随时间下降；
•产品质量随时间变化；
•核型随时间改变；
•染⾊体畸形；
•后⾯两项对蛋⽩类⽣物制品可能影响不⼤，但是细胞中需要考虑的。
相反，通过转染、扩增、筛选获得的⽣产重组蛋⽩的⾼产细胞株可能更不稳定。⾸先⽤于⾼产细胞株构建的⾮整倍体宿主细胞本⾝的稳定性就低于⼆倍体细胞。⾮整倍体宿主细胞除了染⾊体数⽬异常外，还存在染⾊体结构畸形。这就导致了即使同⼀宿主细胞来源的不同细胞株具有不同的核型。核型差异和染⾊体畸形是⾼产细胞株的遗传特性。即使⽣产⽤细胞株在稳定性上可能不及⼆倍体细胞，但是他们必须具备在⼀定的倍增次数内保持其⽣产特性、⽣长状况、蛋⽩质量的相对稳定。
假设进⾏10,000批10,000L规模，最终细胞密度为10E10 cells/L的⽣产，选定的细胞株需要进⾏接近80次的倍增。次数远远超过从⼀个受精卵发育成⼀只仓⿏、⽼⿏甚⾄是成⼈所需要的倍增次数。在如此长的周期内，某些细胞内基因突变、表观遗传学改变或者染⾊体重排不可避免，⽽这是⽬前⽆法解决的。
为测试细胞的稳定性，需要对细胞40-60次倍增范围内进⾏⽣产能⼒以及基因拷贝数的检测。从液氮罐中10e10个细胞复苏到⽣产规模反应器⽣产，细胞需要进⾏15次倍增，所以40次倍增稳定测试就⾜以提供充分的数据。（如果起始细胞为10e7开始复苏，到10,000L反应器需要多少次倍增呢？）
产品质量稳定性更难评估，基因突变，⽐如糖基转移酶突变，可能会会影响产品质量。⼀个或多个拷贝中碱基突变会影响到蛋⽩氨基酸序列。由于基因组中外源基因不同拷贝的转录和翻译效率不同，不同的突变引起的对产品质量的影响不尽相同。通过⾼通量基因测序技术，可以检查出细胞体中甚⾄很⼩⽔平的突变。
结语
在合适培养条件下，⼯业上CHO或杂交瘤来源的⾼产细胞株特异性细胞产量可达到50-100 pg/cell-day，相当于体内专职分泌细胞的⽔平。如此优秀的细胞株通常是通过优化基因结构、筛选和扩增等⽅法获得的。
Cell culture bioprocess engineering byWei-Shou Hu
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