酶液的制备
缓冲液A：l00mmol/L Tris-HCl，pH7.6，含1.0mmol/L EDTA，l.0 mmol/L MgCl2.6H2O，10mmol/L 2-巯基乙醇)，用于粗酶提取。
取适量的叶片，置于冰浴的研钵(预先冷冻)中，加入少量石英砂研磨后，以每g鲜重材料 加3ml抽提缓冲液进行匀浆。匀浆液于Beckman高速冷冻离心机4℃下，12000r/min离心30min，取上清液，在冰浴中分装。整个提取过程要将材料保持在低温条件下，且尽量快速的进行，以防止酶的失活。
GS合成酶活性的测定
按文献(RhodesetaL，1975)报道的方法进行。反应在pH7.2的咪唑缓冲系统中进行，反应总体积为2mL，包括合成酶活性反应液【配方为:50mmol/L咪唑—HCI，40mmo/LMgSO4·7H2O，90mmol/L谷氨酸，6mmoL/l羟胺lml，蒸馏水0.8ml，酶液0.lml】，最终的pH值为7.2。在37℃预热2一3min后加入0.1ml10mmol/L的ATP溶液，立即启动反应。混合均匀后，37℃保温15min，加入酸性FeC13终止液[2%(W/V)TCA网
，3.5%(W/V)FeC13·6H2O，2% HCl lml终止反应，2500g离心5min，取上清液于540nm处用可见光分光光度计测定吸光值。 一个GS活性单位定义为每min于37℃产生1umol的γ一谷氨酞异羟酸 (γ一glutamylhydroxmaate)所需的酶量。
谷氨酰胺合成酶活性的测定
酶液提取：取4～5 片旗叶，去中脉及首尾部分，剪碎后称取0.5 g，加入6 ml（smipH 8.0 ,50 mmol·L-1）的咪唑-HCl 缓冲提取液（含2 mmol·L-1 的MgSO4，0.5 mmol·L-1 EDTA，10mmol·L-1 β-巯基乙醇），冰浴研磨，4℃下15 000×g离心20 min，上清液即为酶液。
显反应：取酶液700 μl 两份，分别加入1.6 ml反应混合液A（pH 7.8，50 mmol·L-1 的咪唑-HCl 缓冲液，含20 mmol·L-1 的MgSO模型仿真4，0.5 mmol·L-1 EDTA，60 mmol·L-1 比利时FNC谷氨酸和10 mmol·L-1 ATP）和1.6 ml 反应混合液B（反应混合液A 中加入10 mmol·L-1 盐酸羟胺），混合均匀后，于30℃水浴反应30 min，然后加入1 ml 显剂（0.2 mol·L-1 TCA，0.37 mol·L-1 FeCl3和0.6 mol·L-1 HCl 混合液），摇匀后放置片刻，于5 000×g 下离心10 min，取上清液测定540 nm下的吸光值。
用γ- 谷氨酰基羟亏酸做标准曲线，以加入反应液B和反应液A的吸光值之差，根据标准曲线查得酶活性。
NADH——GDH活性的测定:德国人的性格
NADH一GDH和NAD+-GDH的活性测定，参照DLulakakis等(1990)的方法。
测活贮备液:115.4mmol/L Tris-HCI(pH8.0），23.1mmol/L 2-OG（酮戊二酸），231mmol/L NH4CI)
NADH贮备液:6mmol/L CaCl2:贮备液:30mmol/L
先在准备好的试管中加入2.6ml测活贮备液，按顺序加入0.l ml CaCl2，0.l ml NADH，0.l ml 蒸馏水。再加入0.lmL酶液启动反应，并于340nm处测定吸光值，三min后再测定一次，计算差值。以水代替NADH和酶液作为空白对照管。
NAD+-GDH活性的测定
NAD十一GDH活性的测定按Lulkaakis等(1990)的方法进行
测活贮备液:115.4mmol/L Tris-HCI(pH9.3)，115.4mmol/L谷氨酸，30mmol/LCaC12
NAD+贮备液:30mmol/L
CaC12贮备液:30mmol/L
测定前先在准备好的试管中加入2.6mL贮备液，0.05mL CaC12，0.1 ml NAD+，0.15ml 蒸馏水。加入0.lml 酶液启动反应，并于340nm处测定吸光值，三min后再测定一次，计算差值。加入贮备液，以水代替NAD+和酶液作为空白对照管。NAD+-GDH活性以每min在30℃下还原1umol的NAD+所需的酶量为一个酶活性单位。
称取新鲜材料1.0 g 于研钵中，加8 mL 提取液（0.2 mmol·L-1，pH 8.2，Tris-HCl缓冲液）冰浴研磨，转移到10 mL 离心管中，4℃、20 000 r/min 离心20 min，上清液即为粗酶液。取1 mL
酶提取液加入2 mL 反应液B（60 μmol·L-1 L-谷氨酸+1.6 μmol·L-1 NAD+0.36 mmol·L-1 Tris-HCl 缓冲液），以加反应液A（1.6 μmol·L-1 NAD+0.36 mmol·L-1 Tris-HCl 缓冲液）为对照，于340 nm 处比，每隔1 min记录一次OD 值，共记录4 次。
NADH一GOGAT活性的测定
NADH一GOGAT活性的测定按文献(林清华等2000)。反应总体积3mL，当加入酶提取液后立即加入L一谷氨酰胺启动反应。于340nm处测定3min内吸光值的变化，以每分钟反应混合液于30℃减少1umol的NADH为一个酶活性单位。
3 PAL的提取和活性测定
取1.5g样品，加10毫升含5mmol/L的巯基乙醇的硼酸缓冲液、0.5gPVP聚乙烯吡咯烷酮，在研钵中研磨成匀浆，过滤，以10000r/min的转速离心15min，上清液即为酶粗提液。上述操作均在4摄氏度进行。
取1ml酶液，加1ml0.02mol/L苯丙氨酸，2ml蒸馏水，总体积为4ml。对照试验则不加酶液，而多加1ml蒸馏水。反应液置恒温水浴30度中保温，0.5h后用紫外分光光度计在290nm波长处测定吸光度。以以每小时在290nm波长处吸光度变化0.01所需的酶量为一个单位（相当于每毫升反映混合物形成1μg肉桂酸）。
试剂 0.05mol/L硼酸盐缓冲液(PH8.8),0.02mol/L 用0.1mol/L硼酸盐缓冲液(PH8.8)配制 5mmol/L巯基乙醇硼酸缓冲液 PVP
试剂
PAL提取液: 0.05mo l/L硼酸缓冲液( pH 8.8) , 15 mmol /L 2- 巯基乙醇, 5 mmo l /L乙二胺四乙酸( E thy lene diam ine tetraccet ic ac id, EDTA ) , 质量分数2% 的聚乙烯基吡咯烷酮( Po lyv inglpyrro lidone,PVP) , 体积分数3%的甘油.
PAL沉淀悬浮液: 0.05mo l/L硼酸缓冲液( pH 7.0) , 15 mmo l/L 2- 巯基乙醇, 5mmol /L EDTA, 体积分数3%的甘油.
PAL的分离提取
参照文献[ 10]的方法略作修改. 称取1 g植物材料, 加入5 mL预冷的PAL提取液, 在高速组织匀浆机上搅碎, 4℃条件下10 000 r /m in离心30 m in, 上清液再用混合纤维素酯微孔滤膜(孔径0
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