牛 超，刘关君，曲春浦，等．谷氨酸合成酶基因及其在植物氮代谢中的调节作用综述［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（９）：１０－１６．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．０９．００３ 谷氨酸合成酶基因及其在植物氮代谢中的
调节作用综述
牛 超１，刘关君１，曲春浦１，冷 雪１，张国壁１，杨成君２
（１．东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江哈尔滨１５００４０；２．东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨１５００４０）
摘要：谷氨酸合成酶（ＧＯＧＡＴ）是植物体内氮素同化与循环的关键酶。深入研究该酶的控制基因及其表达特性，对了解植物氮代谢调控机制并应用于农业生产具有重要意义。根据在高等植物Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ和ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ的生物化学和遗传学方面的研究进展，对其历史进程进行回顾和总结；从在植物中的定位、功能、表达特异性、转录水平调控以及对氮代谢的调控等方面介绍谷氨酸合成酶（ＧＯＧＡＴ）分子生物学研究进展，并展望ＧＯＧＡＴ基因在植物氮代谢中的调节作用，提高氮素利用率（ＮＵＥ）等方面的应用前景。
关键词：谷氨酸合成酶；谷氨酰胺合成酶；Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ；ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ；谷氨酸；氮代谢 中图分类号：Ｓ３１１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）０９－００１０－０６
收稿日期：２０１７－１１－０６
基金项目：国家自然科学基金（编号：３１５７０６４８）；国家“８６３”计划（编号：２０１３ＡＡ１０２７０２）；中央高校基本科研业务费专项资金（编号：ＤＬ１３ＥＡ０３－０１）。
作者简介：牛 超（１９９２—），男，黑龙江伊春人，硕士研究生，主要从事林木氮素营养分子生物学的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｉｕｃｈａｏ１１０３＠ｑｑ．ｃｏｍ。
通信作者：杨成君，博士，副教授，主要从事资源学领域的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｘｙｙｃｊ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
氮素是植物生长发育所必需的基本营养元素［１］
，在植物生长发育和形态建成中起着重要的作用［
２－３］
。植物从外界环境中可直接吸收土壤中的铵态氮、硝态氮等无机氮以及尿素、氨基酸等有机氮，也可通过固氮菌对氮气（Ｎ２
）的固氮作用获得氮素营养［４］。对于ＮＨ４＋
的获取有多种来源，
一部分来自根通过细胞质膜上的专一性转运蛋白吸收的ＮＨ４＋与ＮＯ３－博司捷
，
其中ＮＯ３－由体内细胞质硝酸还原酶（ＮＲ）还原为ＮＯ２－
，再由质体中的亚硝酸还原酶（ＮｉＲ）将进入质体的ＮＯ２－
还原为ＮＨ４＋
；
另一部分来自光呼吸、根瘤菌固氮作用、氨基酸代谢、类苯基丙烷代谢、衰老组织氮化合物转移再利用等多种途
径［５］。ＮＨ４＋进入氮同化途径后，首先ＮＨ４＋
和谷氨酸由谷氨
酰胺合成酶（ＧＳ）催化形成谷氨酰胺，然后由谷氨酸合成酶（ＧＯＧＡＴ）将谷氨酰胺和α－酮戊二酸转变为２分子谷氨酸，其中一分子谷氨酸可作为ＧＳ的底物，而另一分子谷氨酸可
用于合成蛋白质、核酸等含氮化合物。在同化ＮＨ４＋时，
ＧＳ和ＧＯＧＡＴ是同时起作用的，因而该途径被称为ＧＳ／ＧＯＧＡＴ
循环［５］。ＧＳ／ＧＯＧＡＴ循环是无机氮转化为有机氮的第１步，也是目前为止所发现的无机氮转化成有机氮的主导途径［
７］
。高等植物体内９５％以上的ＮＨ４＋
通过ＧＳ／ＧＯＧＡＴ循环同化，ＧＯＧＡＴ是该途径的限速酶［８－９］
。ＧＳ与ＧＯＧＡＴ在植物
叶片、根瘤以及根中均有分布，但在不同器官中ＧＳ／ＧＯＧＡＴ循环的作用不尽相同。在绿组织中，ＧＳ／ＧＯＧＡＴ循环的主
要作用是同化光呼吸产生的ＮＨ４＋
以及硝酸盐在叶中还原产生的ＮＨ４＋；在根瘤中主要同化根瘤菌固氮产生的ＮＨ４＋
，而在根中则是同化吸收到体内的ＮＨ４＋及硝酸盐被吸收后在根中还原产生的ＮＨ４＋。
提高ＧＳ／ＧＯＧＡＴ循环的效率被认为是提高氮素利用率
的一种有效途径［
１０］
，因此对于ＧＳ和ＧＯＧＡＴ基因的研究引起了许多学者的关注。因为ＧＯＧＡＴ基因序列过长（ｃＤＮＡ编码
序列超过６ｋｂ）且不易操作，与ＧＳ相比［１１－１２］
，ＧＯＧＡＴ基因功
能的研究报道相对较少。近年来随着分子生物学技术的进步，对ＧＯＧＡＴ基因的研究逐渐深入。本文主要总结和整理了近年来国内外ＧＯＧＡＴ基因的研究成果，并对ＧＯＧＡＴ在植物氮代谢中的作用及其调控机制进行详细的论述。１ ＧＯＧＡＴ的发现
在１９７０年以前，多数学者认为谷氨酸脱氢酶（ＧＤＨ）催化α－酮戊二酸的可逆还原氨化反应，是活体中氨同化的主
要途径［
１３－１４］
。其反应方程式为：α－酮戊二酸＋ＮＨ３＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋ 谷氨酸＋Ｈ２
Ｏ＋ＮＡＤ＋。 反应式中ＮＡＤＨ为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
１９７０年，Ｔｅｍｐｅｓｔ等报道在产气杆菌的无细胞制剂中检测到可以催化α－酮戊二酸与谷氨酰胺还原形成２分子谷氨酸的酶，命名为谷氨酰胺－α－酮戊二酸氨基转移酶，
别称谷氨酸合成酶，缩写为ＧＯＧＡＴ［１５］。其催化的反应方程式为：
谷氨酰胺＋α－酮戊二酸＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋→２谷氨酸＋
ＮＡＤＰ＋
。 反应式中ＮＡＤＰＨ为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
而先前有关细菌氨同化的研究已证实ＧＳ催化的反应方程式为：
谷氨酸＋ＮＨ３＋ＡＴＰ→谷氨酰胺＋ＡＤＰ＋Ｐｉ＋Ｈ２
Ｏ［１６］
wdb620
。 因此，ＧＳ与ＧＯＧＡＴ的结合产生了细菌氨同化的新途
径，该途径并未涉及到ＧＤＨ［１７］
。对ＧＳ／ＧＯＧＡＴ循环在细菌
中（特别是在低氮供应的条件）调控作用的研究已日趋成熟，
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即使如此，是ＧＤＨ还是ＧＳ／ＧＯＧＡＴ循环主要参与氨同化过程仍然是一个有争议的话题。
研究表明，植物在叶绿体中将亚硝酸盐还原为氨基酸［１８－１９］。然而，叶绿体中ＧＤＨ的活性非常低［２０］，而ＧＳ的活性较高［２１］，因此推测ＧＯＧＡＴ也可能存在于叶绿体中。用完整的豌豆叶绿体进行试验，证明ＧＯＧＡＴ催化谷氨酰胺和α－酮戊二酸形成谷氨酸［９］，该过程是以还原型铁氧还蛋白（Ｆｄ）作为电子供体，方式与ＮｉＲ相似。几乎同时，Ｄｏｕｇａｌｌ报道了在胡萝卜细胞基质中存在以ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ作为电子供体的ＧＯＧＡＴ［２２］。
起初，尚不清楚ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ和Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ酶活是否由同一酶蛋白催化。Ｓｕｚｕｋｉ等研究表明，水稻根系和黄化叶的组织中可以用ＮＡＤＨ和Ｆｄ作为电子供体检测ＧＯＧＡＴ活性［２３］。然而，Ｓｕｚｕｋｉ等从水稻绿叶中提取并纯化到相同性质Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ抗体的蛋白，其抗血清不与ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ交叉反应［２４］。根据免疫学研究，绿叶中的Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ和黄化叶组织中的Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ是密切相关的蛋白质；相反，根组织中的Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ是独特的蛋白质，因此ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ和Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ酶活不是由同一酶蛋白催化。光照生长和黄化的水稻叶片中Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ蛋白含量相同，但Ｓｕｚｕｋｉ等研究表明水稻叶和根中Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ具有相关但不相同的抗原成分［２５］。现已确认在一些高等植物中由２个不同基因编码Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ，并在叶和根中差异表达［２６］。 ２ ＧＯＧＡＴ在植物细胞中的分布及其功能
高等植物中，ＧＯＧＡＴ依据辅酶不同可分为２类，第１类是以Ｆｄ作辅酶，称为Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ，主要存在于质体和叶绿体等绿组织中，参与氮的初级吸收与光呼吸释放氨的再吸收；第２类是以ＮＡＤＨ作辅酶，称为ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ，主要存在于非绿组织中，如根瘤、根、茎和细胞质等，参与吸收氨的同化以及固氮作用。２种酶具有不同的分子量、分子结构、动力学特征及细胞定位，其依赖还原力的专一性和抗原性等方面也都不同，是２种不同的蛋白质，在植物中发挥的作用也不同。
２．１ Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ的定位及功能
Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ首先在豌豆叶的叶绿体中被发现［９］，光照豌豆叶绿体可以促使谷氨酰胺和α－酮戊二酸发生反应，该反应依赖于光反应的放氧作用。进一步研究表明，该反应需要光合作用过程中光反应阶段生成的具有还原力的Ｆｄ作为电子供体，才能完成谷氨酸的合成反应，因此该反应特异地发生在叶绿体中。同时该反应对重氮丝氨酸（ａｚａｓｅｒｉｎｅ，ＧＯＧＡＴ抑制剂）敏感，而对蛋氨酸亚砜亚胺（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ，ＧＳ抑制剂）不敏感。光照叶绿体也能促使氨和α－酮戊二酸参与反应，同样依赖于光反应的放氧作用［２７］。这一过程对蛋氨酸亚砜亚胺和重氮丝氨酸均敏感，可推测ＧＳ和ＧＯＧＡＴ之间的耦合作用催化了该反应。
现已在高等植物叶片［２８］和低等植物藻类［２９］的叶绿体中检测到Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ的存在，
Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ可以占植物叶中总蛋白质的１％［３０］。水稻中Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ具有１１５ｋｕ的２个亚基［２５，３１］，而在其他植物中该酶多数是以单体的形式存在，分子量为１４５～１８０ｋｕ［２０，３２］。使用免疫金抗体定位技术在番茄的叶肉组织、木质部薄壁组织和表皮细胞的叶绿体基质中均检测到Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ相应的蛋白质［３３］。对玉米亚细胞定位及免疫荧光印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ）分析表明，Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ蛋白质主要位于维管束鞘的叶绿体中［３４］，该结果与１９７７年Ｈａｒｅｌ等进行酶活测定的结论一致［３５］。在水稻叶的叶肉组织中，Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ蛋白质和酶活水平最高，在完全展开的成叶薄壁细胞中水平较低，并且在叶鞘和非绿幼叶中水平更低［３６］。同样在大麦中Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ存在于叶肉组织和维管组织的叶绿体中［３７］。在大多数裸子植物（包括针叶树）的叶绿体中没有检测到ＧＳ的存在，然而已在松树的叶绿体中发现ＧＯＧＡＴ［３８］，因此推测在裸子植物中氨同化可能发生在细胞质中。
Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ也存在于非光合组织中，在水稻、玉米、豆类、大麦和豌豆等植物根的质体中均检测到Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ的存在［３７，３９－４０］，其所需还原力的Ｆｄ可能是通过氧化磷酸戊糖途径产生的［４１］。在水稻根中，Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ酶活在根尖细胞中含量最高，随着根细胞的成熟而逐渐降低。在幼嫩组织中，Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ酶活在所有细胞中均能检测到，但在较老组织中只有中柱中能检测到。
２．２ ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ的定位及功能
以ＮＡＤＨ作为电子供体的ＧＯＧＡＴ（ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ）主要存在于植物根中［４２］。现已从水稻悬浮培养细胞和根瘤中提取并纯化到ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ，其单体的分子量为１９６～２００ｋｕ［２０］。然而在细菌中该酶则是由２个不同亚基构成的异源二聚体。在绿叶中ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ的酶活与Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ相比要低得多［２０］。Ｙａｍａｙａ等研究表明，在水稻非绿和正在发育的叶片中仍存在高水平的ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ蛋白质和酶活，而Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ则在完全展开的成熟绿叶中占主导地位［３６］。组织免疫印迹分析表明，ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ存在于水稻幼叶的维管薄壁组织细胞和维管束鞘细胞中；但在缺氮水稻根中，ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ相应的蛋白质在中柱、顶端分生组织和次生根原基中均能检测到［４３］。
３ ＧＯＧＡＴ基因的表达
已有研究表明，叶绿体中的Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ主要负责光呼吸过程产生的氨的回收与利用。Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ在受光调控的同时也受供氮条件的影响，例如大麦在光照条件下，供应硝态氮，叶中可检测到更高水平的Ｆｄ－ＧＯＧＡＴｍＲＮＡ、蛋白质和酶活［４４］。但不同物种或不同部位存在一定的表达差异，如在烟草叶片中，无论是通过抑制光呼吸还是抑制硝酸还原都会导致氨的减少，对Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ基因的表达、蛋白质含量和酶活都没有影响［４５］。
与绿组织中表达的Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ相比，ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ主要在非光合作用组织及正在发
育的叶片中表达，尤其在根部不同组织中会大量表达，且受氮素诱导明显［１３，４６］。ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ主要参与氮素固定、硝酸还原及直接吸收产生氨的同化作用［４７］。在水稻细胞培养物或根中，从缺氮状态转到供氮状态后，ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴｍＲＮＡ积累显著增加［４８］。在铵态氮处理的大豆幼苗根中，ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴｍＲＮＡ的表达量、蛋白质含量及酶活都显著增加［４９］。无论供应低氮还是高氮，水稻根瘤中ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ表达水平均较高，因此推测ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ可能在菌根氮吸收过程中发挥关键作用［５０］。
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江苏农业科学 ２０１８年第４６卷第９期
４ ＧＯＧＡＴ调控氮代谢４．１ ＧＯＧＡＴ基因的调控
对于ＧＯＧＡＴ基因的调控，可通过ｍＲＮＡ、蛋白质及酶活等相关指标进行分析。在一些植物的子
叶和叶中，Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ受光的诱导，随着ｍＲＮＡ水平和蛋白质含量的增加，其酶活也大幅增加
［２０］
。在拟南芥中，Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ１ｍＲＮＡ
水平受光影响在短时间内（３ｈ）显著增加，并在２４ｈ达到峰值，而Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ２ｍＲＮＡ水平受光的影响很小。黑暗处理对Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ１ｍＲＮＡ的诱导作用不明显，当施加适量的蔗糖后，可以部分替代光照对Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ１ｍＲＮＡ的诱导作用，但对Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ２无影响
［９］
，因此推测在拟南芥中Ｆｄ－
ＧＯＧＡＴｍＲＮＡ转录水平和酶活的诱导是光通过植物素介导的。Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ的酶活也受供氮情况的影响，这可能与光
照有关［２０，５１］
。在光照条件下，大麦叶中检测到Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ
ｍＲＮＡ、蛋白质和酶活含量是正常条件下的２倍，如果再施加适量的硝态氮，可检测到更高水平的Ｆ
ｄ－ＧＯＧＡＴｍＲＮＡ、蛋白质和酶活并且植株生长更加旺盛［４４］。然而，在未供氮的多
数植物中其水平仍明显存在，如在烟草叶中，通过抑制光呼吸或硝态氮的还原降低了氨的含量，但Ｆｄ－ＧＯＧＡＴｍＲＮＡ、蛋白质和酶活水平均不受影响
［４５］
。在黑暗生长的大豆幼苗中，
当供应ＮＨ４ＮＯ３时在根中可以检测到Ｆｄ－ＧＯＧＡＴｍＲＮＡ、蛋白质和酶活水平的升高，但对光照下生长的植物效果则不太明显。目前关于铵态氮或硝态氮对下胚轴／茎、子叶或叶中Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ酶活的主要作用仍然是争议的话题。在大豆中，当供应（ＮＨ４）２ＳＯ４时，根中的Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ酶活增加，而ｍＲＮＡ和蛋白质没有相应的增加［４９］
。大多数情况下，在植物
新叶的发育和生长过程中，伴随着光合作用和光呼吸的增强，
Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ酶活显著增加［５２］
。在大麦中，随着新叶的发育，
Ｆｄ－ＧＯＧＡＴｍＲＮＡ、蛋白质和酶活含量有所增加，而后随着叶
片的衰老而减少
［４４］
。Ｍａｓｃｌａｕｘ等重新研究了烟草叶片发育
和衰老时氨同化过程发生的代谢，发现在植物顶部的第２５～３０片叶中，
Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ蛋白质和酶活含量较高，但在老叶中明显降低，直到植物底部的后９片叶中其表达量几乎消失，这一现象可能与植物衰老有关
［５３］
。Ｒｕｂｉｓｃｏ（核酮糖－１，５－二
磷酸羧化酶）和叶绿体ＧＳ２的大小亚基显示出类似蛋白质数量上的减少，因为随着叶片的成熟须要合成更多的谷氨酰胺，而嫩叶须要生长，因此须要谷氨酸用于其他氨基酸的合成。相反，细胞质ＧＳ１和ＮＡＤＨ－ＧＤＨ随着叶片衰老而增加。目前已经在葡萄树的叶中证明了Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ的酶活有类似的变化
［５４］
。
对于Ｎ
ＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ基因的调控，当水稻幼苗从氮饥饿状态转到供应１ｍ
ｍｏｌ／Ｌ铵态氮中，根中ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ蛋白质和酶活水平在１ｄ内增加了１０倍以上［４６］
。在水稻细胞
培养基或根中施以低至５０μｍｏｌ／Ｌ铵态氮后，在１２ｈ内也可
检测到ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴｍＲＮＡ水平的增加
［４８］
，并且推测谷氨
酰胺可能作为其转录水平增加的信号。然而，大田软海绵酸是蛋白丝氨酸／
苏氨酸磷酸酶的有效抑制剂，并且能诱导水稻细胞培养基中ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ的积累。因此，调控ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ基因表达信号的传递机制仍是争议的话题
［５５］
。进一
步研究表明，光照或各种氮素处理下的大豆子叶或下胚轴／茎
中Ｎ
ＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ酶活几乎没有影响。然而，在向氮饥饿的幼苗中加入适宜的铵态氮后，根中的酶活增加了近１４倍。施加适量的氮源后也检测到ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴｍＲＮＡ和蛋白质水
平的小幅增加［
４９］
。４．２ Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ基因表达量的改变对氮代谢途径的影响
外界氮素的变化往往会对植物的基因表达产生难以预料的影响，进而干扰结论的准确性；因此，要确定ＧＯＧＡＴ基因调控氮代谢，最直接的办法是在适合的氮素条件下提高和降低该基因的表达，观察相关产物和底物变化，同时检测其他相关基因的表达情况，从而分析ＧＯＧＡＴ基因及其相关基因表达的相互关系。
４．２．１ 过表达Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ基因 对于Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ基因的过表达，目前仅限于模式植物拟南芥中。Ｉｓｈｉｚａｋｉ等研究了拟南芥过表达Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ（ＧＬＵ１），在控制ＣＯ２浓度、
光照度和ＮＯ３－浓度条件下改变ＮＨ４＋
的摄入量，导致谷氨酸过量生成，进一步研究表明总氨基酸库也发生变化［５６］
。在光呼吸条件下供应充足的ＮＨ４＋
时天冬氨酸含量增加，
谷氨酰胺和甘氨酸含量减少，但这种改变并不显著；在非光呼吸条件下，谷氨酸和其他氨基酸含量增加。结果表明，合成的谷氨酸被迅速转化成其他氨基酸，特别是天冬氨酸。
４．２．２ 抑制表达Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ基因 对于Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ基因抑制表达的研究主要集中在近几年，
２０１０年，Ｋｉｓｓｅｎ等通过全基因组微阵列方法分析敲除Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ１（ＧＬＵ１；Ａｔ５ｇ０４１４０）的拟南芥ｇｌｕ１－２突变体叶和根中表达谱的研
究［
５７］
。结果表明，ｇｌｕ１－２突变体的表达谱显示在叶片中超过５５
００个基因的表达发生变化，在根中近７００个基因受显著影响。参与谷氨酸生物合成与转化的基因都发生变化，通过核磁共振（
ＮＭＲ）代谢组学分析表明氨基酸组成发生变化。在ｇｌｕ１－２突变体中谷氨酰胺水平升高且最为显著。对敲除Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ１／ＧＬＵ１的突变体进行相关基因表达分析表明，其中受影响的有
光合作用、光呼吸和叶绿素合成途径，结果显示在ｇｌｕ１－２叶中Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ１水平全面下调并且其表型一致呈轻微萎黄。ｇｌｕ１－２表达谱揭示的另一方面是受多重应激反应，包括冷、热、干旱和氧化应激，参与类黄酮生物合成基因的表达量也发生变化。基因编码大多数应激相关的转录因子、细胞素Ｐ４５０单加氧酶、谷胱甘肽Ｓ－转移酶和ＵＤＰ－糖基转移酶在ｇｌｕ１－２突变体得到表达并受影响。这些结果表明Ｆ
ｄ－ＧＯＧＡＴ１的重要性，还间接证明在植物生长发育过程中谷氨酸起核心作用。２
０１６年，Ｙａｎｇ等报道编码水稻Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ的ＡＢＣ１（ＡＢＮＯＲＭＡＬＣＹＴＯＫＩＮＩＮＲＥＳＰＯＮＳＥ
１，细胞分裂素反应异常１）基因的功能特性［５８］
。突变等位基
因的ａｂｃ１－１突变体具有典型的缺氮综合症，而Ｔ－ＤＮＡ插入的ａ
ｂｃ１－２突变体幼苗是致死型。代谢组学分析显示在ａｂｃ１－１突变体中高氮碳比（谷氨酰胺和天冬酰胺）的氨基酸和ＴＣＡ循环中几种中间产物过度积累，表明ＡＢＣ１在氮同化和碳氮平衡中起关键作用。在Ａ
ＢＣ１编码区中鉴定了５个非同义单核苷酸的多态性，并被定义为３种不同的单倍型，其在粳稻和籼稻亚种之间有较高的、特异性的分化。结果表明ＡＢＣ１／ＯｓＦｄ－ＧＯＧＡＴ调节氮同化和碳氮平衡对植物生长和发育至关重要。２
０１７年，Ｚｅｎｇ等分离出名为ｇｏｇａｔ１的水稻早熟叶的衰老突变体，其在叶中ＧＯＧＡＴ总酶活性降低
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２１—江苏农业科学 ２０１８年第４６卷第９期
６７％［５９］。ｇｏｇａｔ１突变体在自然条件下表现出萎黄病，而在低光照条件下，叶片衰老程度较缓慢。ｇｏｇａｔ１突变体表现出结实率的降低，而ｇｏｇａｔ１突变体的籽粒蛋白质含量（ＧＰＣ）显著高于野生型。同时，在灌浆期，上数３片叶和顶部节间的总氨基酸含量大幅增加。结果表明，ＯｓＦｄ－ＧＯＧＡＴ可能参与叶片衰老过程中氮的再动员，并为提高水稻氮素利用效率提供潜在的途径。
４．３ ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ基因表达量的改变对氮代谢途径的影响
４．３．１ 过表达ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ基因 关于植物ＧＯＧＡＴ基因过表达的研究较少，特别
甲苯二异氰酸酯用途是ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ基因的过表达，研究者认为导致此结果的原因可能是ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ基因较长，在大部分植物中约６～７ｋｂ，不利于转基因。目前对于ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ基因过表达的研究，仅在烟草和水稻的文献中有报道。２００１年，Ｃｈｉｃｈｋｏｖａ等以ＣａＭＶ３５Ｓ作为启动子，将苜蓿ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ基因转化到烟草中，得到３个转化子（ＧＯＳ１０、ＧＯＳ１３和ＧＯＳ１９）［６０］。分子检测表明，ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ在ＧＯＳ转基因株系的叶和根中低水平表达，但在宿主烟草该基因的表达几乎检测不到。ＧＯＳ转基因株系根中ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ酶活较对照植株有所提高（约１５％～４０％）。在温室生长的ＧＯＳ转基因植株与对照植株相比，以ＮＯ
平角怎么表示３
－或
ＮＨ
４
＋作为唯一氮源时植株进入开花期，表现出地上部干质量和总碳氮含量均有所增加。因此推测，通过转基因增强ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ酶活，能使ＧＯＳ转基因烟草具有较高同化氮的能力。２００２年，
Ｙａｍａｙａ等采用免疫学方法分析表明［６１］，水稻衰老器官再动员产生的谷氨酰胺，经由韧皮部运输至正在生长发育的器官中进行重新利用，ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ参与了这一过程。在水稻中过表达ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ，可使其粒重有所增加（最多为８０％），表明在水稻中ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ是提高氮素利用率和籽粒灌浆的关键酶。
４．３．２ 抑制表达ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ基因 对ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ基因的抑制表达，目前在苜蓿、拟南芥和水稻等模式植物中有相关报道。２０００年，Ｓｃｈｏｅｎｂｅｃｋ等利用ＡＡＴ－２（天冬氨酸转氨酶，根瘤中表达增强）启动子调控的反义ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ转基因苜蓿［６２］。其中１个转基因株系ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ酶活降低约５０％，相应的蛋白质和ｍＲＮＡ含量也有所降低。但该株系的细胞质基质ＧＳ、Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ、ＡＡＴ－２、ＡＳ（天冬氨酸合成酶）和ＰＥＰＣ（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）的转录丰度以及ＧＳ、ＡＡＴ和ＰＥＰＣ酶活均不受影响。在根瘤共生条件下转反义ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ植株，即使共生固氮没有显著减少，也表现出适度的萎黄、生长迟缓以及含氮量降低等现象。但当供
应适量的ＮＯ
３
－时缓解了萎黄现象，恢复增长以及含氮量。另外，转反义ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ植株雄性不育。这
些数据表明，ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ在共生固氮的同化和花的发育过程中起关键作用。
２００２年，Ｌａｎｃｉｅｎ等在拟南芥ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ（ｇｌｔ１－Ｔ）敲除突变体中发发现，ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴＧＬＴ１ｍＲＮＡ在根中的表达水平明显高于叶中［６３］。该表达模式与主要编码Ｆｄ－ＧＯＧＡＴＧＬＵ１基因形成对比，ＧＬＵ１在叶中表达最高并参与光呼吸。对不同器官特异性的表达模式表明ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ和Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ基因产物的生理作用是非冗余的。代谢分析表明当抑制光呼吸（１％ＣＯ
２
）时，同野生型相比，
ｇｌｔ１－Ｔ突变体在生长和谷氨酸生物合成中有特定的缺陷，即在这些条件下，ｇｌｔ１－Ｔ突变体的生长量下降约２０％，谷氨酸含量也骤减７０％。２０１４年，Ｋｏｎｉｓｈｉ等探究ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ在拟南芥根中氮同化的作用［６４］。对拟南芥供应铵态氮后，ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交分析表明在根中检测到ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ的积累。ＧＵＳ染和免疫组织学分析表明ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ高度累积在非绿组织的维管束、顶端分生组织、花粉、柱头和根中。通过ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ插入Ｔ－ＤＮＡ的突变
体研究表明，与正常ＣＯ
２
条件下相比，其谷氨酸的合成和其株系的生物量积累均显著降低，因此推测ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ在拟南芥根的氮同化过程中具有重要作用。
水稻主要生长在厌氧环境中，ＮＨ
４
＋是其优先选择的无机
氮素。ＮＨ
４
＋的同化是通过ＧＳ和ＧＯＧＡＴ发生的耦联反应进行的。在水稻中，已经鉴定了４个编码ＧＯＧＡＴ的基因，分别为Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ１、Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ２、ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ１和ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ２。ＯｓＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ１主要在根尖、发育叶片和谷粒中表达，ＯｓＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ２主要在完全展开的叶片和叶鞘中表达。２０１０年，Ｔａｍｕｒａ等通过反向遗传学方法分离出敲除缺失ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ１基因的突变体，研究表明，这种同工酶对
幼苗期根中ＮＨ
４
＋的同化起着重要作用［６５］。２０１１年，Ｔａｍｕｒａ等对缺失ＯｓＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ２突变体进行研究［６６］。田间试验表明，ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ１对有效分蘖数的增长也起到非常重要的作用。ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ２和Ｆｄ－ＧＯＧＡＴ在突变体中的表达与野生型是相同的，这表明其他ＧＯＧＡＴ是无法弥补缺少ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ１的功能。Ｌｕ等用全基因组微阵列数据库分析水稻ＧＯＧＡＴ基因的转录模式，探究ＧＯＧＡＴ基因对水稻ＧＯＧＡＴ共抑制植株碳氮代谢的影响［６７］。表达谱表明，水稻ＧＯＧＡＴ基因家族成员在不同组织和器官中表达不同，说明它们在水稻体内扮演不同的角。与野生型相比，ＧＯＧＡＴ共抑制植株的分蘖数、地上部干质量和产量明显降低。生理和生化研究表明，在ＧＯＧＡＴ共抑制植株叶片中硝酸盐、多种游离氨基酸、叶绿素、糖、磷酸糖和吡啶核苷酸的含量明显降低，但
叶片中游离ＮＨ
４
＋、α－酮戊二酸、异柠檬酸的含量有所增加。因此ＧＯＧＡＴ在碳氮代谢中发挥着重要作用，并且在水稻氮同化过程中是必不可少的。
２０１４年，Ｙａｍａｙａ等通过反向遗传学方法分析水稻中３种细胞质基质ＧＳ（ＧＳ１；１、ＧＳ１；２和ＧＳ１；３）和２种ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ（ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ１和ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ２）同工酶的功能［６８］。ＯｓＧＳ１；２和ＯｓＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ１主要在水稻根表层细
胞中表达并受ＮＨ
４
＋影响。插入内源性逆转录转座子Ｔｏｓ１７破坏ＯｓＧＳ１；２或ＯｓＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ１基因，导致有效分蘖数的减少从而降低稻穗数。在敲除突变体中重新转入自身启动子调控下的ＯｓＧＳ１；２基因，可使稻穗数成功恢复到野生型水
平。研究结果表明，水稻根系ＮＨ
４
＋同化过程中ＧＳ１；２和ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ１起主要作用。ＯｓＧＳ１；１和ＯｓＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ２主要在成熟叶片维管组织中表达。在ＯｓＧＳ１；１突变体中稻穗的增长率和灌浆率急剧下降，而在缺失ＯｓＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ２突变体中每穗粒数则明显减少。当ＯｓＧＳ１；１基
因重新转入到ＯｓＧＳ１；１突变体后表型可恢复到近似野生型水平。因此，这２种ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ酶可能在自然衰老期间对氮素
—
３
１
—
江苏农业科学 ２０１８年第４６卷第９期
再动员起重要作用，这些同工酶彼此之间不能弥补其缺失的功能。２０１４年，Ｐéｒｅｚ－Ｔｉｅｎｄａ等用ＡＭ真菌（Ｒｈｉｚｏｐｈａｇｕｓｉｒｒｅｇｕｌａｒｉｓ）侵染水稻，获得转基因株系并在２种氮素处理条件下检测其菌根中Ａ
ＭＴｓ、ＧＳ和ＧＯＧＡＴ基因表达情况。结果表明，ＡＭ共生系统在低氮条件下ＯｓＡＭＴ１；１和ＯｓＡＭＴ１；３下调表达，在高氮条件上调表达。无论是高氮还是低氮条件ＯｓＡＭＴ３；１都有较强的上调表达。因此推测，在水稻根中ＯｓＡＭＴ３；１可能参与了菌根氮吸收途径，ＯｓＧＯＧＡＴ２在ＡＭ诱
导的转运蛋白ＯｓＡＭＴ３；１供应ＮＨ４＋的过程中起重要同化
作用
［５０］
。
山东省主体功能区规划５ 展望
迄今为止，关于植物ＧＯＧＡＴ基因的研究及其在植物氮代谢调控中的应用已经取得了一定进展，主要集中在模式植物和作物，但对木本植物的研究则较少。杨树是多年生落叶木本植物的代表植物，基因组背景清晰，包括转基因在内的相关分子生物学研究手段已经成熟；同时，杨树易于无性繁殖，可在短期内获得大量具有同一遗传背景的无性系材料，并对外界氮素条件的变化具有非常好的适应性，这是其他模式植物无法比拟的优势。但对于杨树，氨的吸收与同化机制的研究却鲜有报道。笔者所在课题组以杨树为试材，在研究ＧＯＧＡＴ基因的同时对氨吸收及同化过程中相关基因表达的协调性进行分析，其结果在丰富植物氨吸收与利用相关理论的同时，也将揭示木本植物中氨吸收与利用的特有机制，为利用基因工程等手段提高木本植物的氮素利用率奠定有利的理论基础。
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ｏｔｅｉｎ，ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
—４１—江苏农业科学 ２０１８年第４６卷第９期
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