SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit User Manual
l^ibk or Contents |
内容 | 页 码 |
L概要简介 | |
II•成分 | |
m •另备物品 | |
IV. BD SMART RA€E AmpliRcaLn 基本康理 "引物设计 | |
VL Poly A RNA和总RNA的制备 | |
vn. cDNA的弟一密的舍成 | |
vm pat阳性对豐 | |
QC3N碌端的快速扩ifl(RACE)l | |
| |
XL疑难解答 | |
|
| |
501 •参考文献
xm •相关产吕
附录加5 -RACE流程图示
附录皿3-RACE 图示
PH 录C; SupprffiHoa PCR and StetMJiH PCR 39
茴小
5TD25VN-3*(N = A,C,G 曲戸 V = A, C,orC)
•7pl BD PoiverScrlpl™ Reverse I^-anscriptaM
中国重型机械总公司•200 pl 5X FirabSLrdnd Buffer
250mMTHs-HCI (pH 83)
375 mM KC1
30 niM Mgpl2
•200 pl DJthiothreitol (DTT; 20 mM),二硫苏權醉
•1ml Deianitzecl H2O
5••& 3 -RACE PCR
•400 pl 10X Universal Primer A Mix (UPM)
Long (0.4 pM):
5,-CIAAIACGA€TGACTXrAGGGCAAG-CAGTCGIATGAACGCAGAGT-3, Short (2 pM):
5,-^.4ATACGACTCACTATAGGCC^
•50 pl Nested Unh ersal Primer A (NUP; 10 pM>
5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT7
Control Reagents
•5pl Coatrol Human Phcental (胎盘)Total RNA (1 pg/pl)
■ 25 pl Control 5 -RACE T¥R Primer (10 pM)
•25 pl Control 3'RACE IVR Primer (10 PM)
General Reagents
•70 pl dNTP Mix (dAl£ dCTP, dGTP, and dTTP, each at 10 mM)
•2Xlml l¥kine-EDTA Buffer理论月刊
10 mM Tricine-KOH (pH 8.5)
1.0 mM EDTA
NudeoIYap® Gei Extraction Kit (CaL No 636053 or K3070-y)
•100 pl NudeoTrap Suspension
•3 ml NT1 Buffer
•10 ml NT2 Buffer
•2ml N13 Buffer
•User Manual (PT3l6d-l)
Free Lrial-size BD Advantage™ 2 PCR Kh (Cat No. 639207or K19l0-y)
Tho BD Advanuge 2 kit provider suf fie ieni roagenls for 30 PC R reactions.
The following a)m|X>nenls are included:
•30 pl SOX BD Advantage 2 Polymerase Mix
•200 pl 1 OX BD Advance 2 PCR Buffer
•30 pl SOX dNTP Mix (10 mM S)
•30 pl Control DNA Template (100 n^/pl)
•30 pl Control Primer Mix (10 pM each)
•1 ml PCR-Grade Wator
•User Manual (PT3281-1)
III.另备物品
下列试刑襦另外准笛；
•0.5-1 nl PCR 花糖纸反应管.推荐使用 PerkinElnier GeiwAmp O.S-ml fXMClion tubes (dl. No. N8ai-O737ufN0Ol-O18O).
•Mineral oil («.g., Sigma CdL Na M-3516)
俺小
IV BD SMART RACE的要点
使全面闻读
•所有妙锻均经过优彳匕 但可能因所使用的辭、根版、引物和然循环仪而不同•因此应使 用 Control Human Pldceeiul ToliI RNA5R]Cantrol T- anil 31- RACE TF*R Prinwns进
PCR的效率取决于试腌样品RNA中mRNA的丰盛•另外ig火延伸遍廈也 依引韧不同而变化.诗参照第X节的侵议优彳匕PCR的条弁•
丑进行5f-RACE and 3--RACE PCRK必别便用热启动。本手册巳经过优仏 所便用 的BD Advantage 2 Polymerase Mix中包含BDTaqSurt抗体用于目动逬行PCR的热启动 （Kellogg etal., 1W4）a 也可以手^（D*Aquilaet al., 1991>««用第珠（Chou e< 儿 1 的2）来 进行那启动。
•推荐使用试刑盒中提供的TYicine-EDTA缓冲液稀猝和S&DNA样品。Tricineig冲液在 禺温下较少年军校活动被写入哪部法律TriMbgli#冲液有更好的罐冲能力.TYuibuscd tg冲液会导SpIlW低.弓I起 DN八的障解°
•整个过程要妙手宣以防核酸胡污染。
2014山东高考作文-SB悬过程（包括吸入和歐岀涪茨）資轻缔.短暂海心便所有成分眾集
•无待别标示.所有操作均应在冰上进行.
舍胡在最后加人。
•使用推荐的KD0AS,该竝已径过特别的就也
・eu是致痊物质，小心处理和使用.
M引物设计
凡引物序列
特异引 1fl（Cene-Specl fic Primer r GSPs） J2 当：
•23-2H个核音馥
50-70%
-Tm ^5°C F如果Tm >70。（2可获得堪好的结果（可便用felJltouchdownPCR^ 根版、引物及RACE产物如图?所示.至少福要两个特冥引物才能进行完整的BD SMART RACE： B
0用于S'-RACE PCRBtJ反义引物和用T3-RACE PCR的IE义引物。如 果只进行5••取丁・RAUE则只需一个特异引梅。引物长康在23-2E个核音酸，长于30个核 言酸没有优势.
如囹3所示，两种引物的⑺』idARACE扩増产物存在部分里気 如果在星燮区有一 个合适的限制性前切位点，可以逸过酶切和连搔反应可以得到OJNA的全长。将两个引 物设计应其RACE产物有106-20W）p的匿整的形式，就能够民舍使用作为叱R反应的 B日性炖風引捌并非一定要设计成较得星聖片断的形式対于大或稀有dJNJU.引物启 好雯设计的尽盘邪近cDNA的末附 不产生垦爱■此外.引挖目身可以工聲（$0互卄） 特异引物GC含■为50-70% ,拭至少65。口使用1心窗neighbor分析（Freier etal.z 1%G;我们便用Primer Punier®?件来计鼻Tm© Tm.应尽可能大于粮据我们旳经彩电视机价格
验.氏引物旳退火温厦高于70。匸待别从困难的样品中可以得到强旳RACE旷Tm-s 超过7『C可臥使用WJSPCRo此外GSPL和GSP2设计成興有相似的Tm•将更有利于使用。 通过计算或试验能够得封GSP1和GSP2的TmS曼邂免使用内部互补的引物或引物之 何互补的引物.尤具在引物旳;T末端互 注意土不更将刮切位点都舍井到5•和3羽异引柯的5侏ML根据们的经验.这些
191外的圧列将会增加反应呼象，
w-wr^rf
E篩" k* ZE
SSSWg5AAMwt?A/UyV\MAAAAA J
*TT*T.f
Figure 3. The relationship (rf gene-spedJic primers to the cDNA template.
B・引籾在基因上Affifi
尽首我们使用BD SMART RACE Kii成功地得到了穴于65 kb扩增产挤 但为了使你旳 5•■和『RACE产物达劃2 kb,建议対引物加以第选•
C. P9 ^EtouchdownPCR
我们发現WSPCRCDunotal., 1991; Roux, 1995）明显填加BD SMART RACE扩增的待 异性*阵落PCR的退火温度符合苜次PCWS坏的Tm高于通用引物的TnuJfl果你的特异 引初Hm在这空循环中将只有与墓因特异性箔合旳引柄炭生液合.从而积累一定盘 的特定产物。退火温度在隨后降低到与通用引物相配合的視度.引起特异性基因模版 旳!8数和高效率的扩《L
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议