1、范围
禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测的操作方法，适用于活禽及其产品中禽流感病毒的检测。
2、缩略语
缩略语:
荧光RT-PCR，荧光反转录-聚合酶链反应。
Ct值，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
RNA，核糖核酸。
DEPC，焦碳酸乙二酯。
PBs，磷酸盐缓冲盐水。
Taq酶，TaqDNA聚合酶。
3、原理
禽流感病毒各亚型均属A型流感病毒，根据A型流感病毒共有基因特定的序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针与禽流感病毒特有的共同基因特异性结合，结合部位位于引物结合区域内。探针的5’端和3’端分别标记不同的荧光素，如5’端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团(用R表示)，3’端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收 5’端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团(用Q表示)。
当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q 基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探面结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5’→3’外切核酸酶的功能，将探针水解成单核苷酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收；在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链，R和Q 基团均游离于溶液中，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。
4材料与试剂
4.1仪器与器材
荧光RT-PCR检测仪
高速台式冷冻离心机(离心速度12000r/min以上)
台式离心机(离心速度3000r/min)混匀器
冰箱(2℃~8℃和-20℃两种)
微量可调移液器(10L、100uL、1000uL)及配套带滤芯吸头Eppendorf管(1.5mL)
4.2试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。 氯仿：异丙醇:-20℃预冷；
PBS:121±2℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000U/mL；
氟盐75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水(符合GB6682-92要求)配制，-20℃预冷；
禽流感病毒通用型荧光RT-PCR检测试剂盒。
5抽样
5.1采样工具
下列采样工具必须经(121±2)℃，15min高压灭菌并烘干：棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5mLEppendorf管、研钵。
5.2.1活禽
取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下:
--取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3次～5次取咽喉分泌液；
民商法论丛--取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便；
--将拭子一并放入盛有1.0mLPBS的1.5mLEppendorf管中，加盖、编号。
5.2.2肌肉或组织脏器
待检样品装入一次性塑料袋或其它灭菌容器，编号，送实验室。
5.2.3血清、血浆
用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。
5.3样品贮运高三语文教学反思
样品采集后，放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品，放一个塑料袋)，于保温箱中加冰、密封送实验室。
5.4样品制备
5.4.1咽喉、泄殖腔拭子woc
样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转入无菌的
1.5mLEppendorf管中，编号备用。骨丢失
5.4.2肌肉或组织脏器
取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mLPBS混匀，4℃，3000r/min离心15m
in，取上清液转入无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。环境法学论文
5.5样本存放
制备的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置-70℃以下，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。
6操作方法
6.1实验室标准化设置与管理
禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测的实验室规范。
6.2样本的处理
在样本制备区进行。
6.2.1取n个灭菌的1.5mLEppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和(阳性对照阴性对照在试剂盒中已标出)，编号。
6.2.2每管加入600μL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL，一份样本换用一个
吸头，再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。于4℃、12000r/min
离心15min。
6.2.3取与6.2.1相同数量灭菌的1.5mLEppendorf
管，加入500L异丙醇(-20℃预冷)，做标记。吸取本标准6.2.2各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500uL，不能吸出中间层，颠倒混匀。
6.2.4于4℃、12000r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)；加入600μL75%乙醇，颠倒洗涤。
6.2.5于4℃、12000r/min离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。
6.2.64000r/min离心10s(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议