基于高通量测序技术的鱼类环境DNA研究中通用引物的筛选验证 全国污染源普查条例西华大学图书馆张爱菊; 郝雅宾; 郭爱环; 刘金殿; 练青平; 周志明
【期刊名称】《《浙江农业学报》》
【年(卷),期】2019(031)010
【总页数】9页(P1615-1623)
【关键词】引物验证; 环境DNA; 高通量测序; 钱塘江
【作 者】张爱菊; 郝雅宾; 郭爱环; 刘金殿; 练青平; 周志明
【作者单位】浙江省淡水水产研究所 中国水产科学研究院东海水产研究所浙江研究中心 浙江省淡水水产遗传育种重点实验室 农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室 浙江 湖州 313001
【正文语种】中 文
【中图分类】S917.4
2008年，法国学者Ficetola等[1]利用从水中提取的环境DNA(environmental DNA，eDNA)检测水域中是否有入侵物种美国牛蛙(Rana catesbeiana)，开启了eDNA技术在水生生物实时监测中的研究与应用。eDNA是指可以从环境样品(如水、土壤、空气等)中直接提取到的DNA片段总和，既包含生物体经由皮肤、尿液、粪便、黏液等释放到环境中表皮细胞中的胞内DNA，也包括细胞死亡后裂解释放到环境中的胞外DNA[2]。eDNA技术的原理是在确定调查物种或种的特异性基因识别片段的基础上，利用各种分子手段检测从环境介质中所提取eDNA包含识别片段的情况，进而确定取样环境中生物的分布状况[3-4]。
eDNA被提取后，需要采用高通量测序或克隆测序等技术进行后续实验分析。目前欧美或日本等国将eDNA技术应用于目标物种(如入侵物种、濒危物种及其他稀有物种)的检测、资源量的估测、水体生物多样性的调查等方面[5-7]。国内eDNA技术的利用研究尚处于起步阶段，多采用克隆测序技术检测水中的目标物种和物种多样性[8-11]。然而，不论哪种测序技术，利用eDNA进行落结构分析都需要有合适的通用性引物。由于环境中DNA易于受到紫外线和微生物分解作用的影响，物种的长DNA片段十分容易降解，故短DNA片段普遍 被用于eDNA研究[2，12-13]。然而，不同的引物获得的扩增结果往往差异很大[14]。因此，筛选出一个通用性和适用性都比较理想的通用引物是利用eDNA技术研究鱼类落结构的关键技术之一。 高通量测序技术的核心思想是边合成边测序，相比于克隆测序具有耗时短、获得信息全等优点。Illumina Miseq测序平台是高通量测序的一款小型测序平台，可以高通量、并行对核酸片段进行深度测序，目前可以支持500～600 bp的读长。由于Miseq测序读长的限制，同时也为了保证测序质量，最佳测序的插入片段范围是200～450 bp，故选取的引物扩增产物片段大小也应在此范围。由于鱼类区系的差异，我国水域生态系统中的鱼类落结构与国外不同，因此国外研究中提供的鱼类通用引物的通用性和适用性也有待进一步验证。第五次人口普查
钱塘江是浙江省第一大河，流域面积约5.5万km2，历来是杭州市的主要饮用水源地，除此之外，钱塘江还兼具发电、防洪、灌溉、游览等多种功能。近年来，随着钱塘江流域经济的快速发展和城市化进程的加快，以及水利工程建设、采砂作业、渔业资源的过度捕捞等人为因素的影响，水域环境发生变迁，其渔业资源体结构也随之发生变化。据统计，20世纪70年代末80年代初，钱塘江可以采集到的鱼类标本有136种；1986—2001年钱塘江杭
州段可采集到的鱼类标本为127种；2014—2015年，钱塘江杭州段采集到的鱼类标本为70余种。这些结果均通过传统的捕捞调查方法获得，但由于方法的限制，可能导致一些常规种类未采集到的情况。本研究从国内外文献中筛选出5对线粒体基因组部分片段的通用引物，采用Illumina Miseq法对这些引物在钱塘江富阳段环境样品中的通用性和适用性进行了研究，以期为钱塘江水系鱼类多样性及水生生态系统保护提供参考。
1 材料与方法
1.1 水样采集和DNA提取
2017年6月在钱塘江富阳段中下游选取9个点采集表层水样，每份样品5 L，立即带回实验室后放入4 ℃冷藏箱，24 h内对水样进行抽滤处理，使用滤膜孔径为0.45 μm[8，15]。使用Omega公司生产的试剂盒EZNA water DNA kit提取滤膜中的eDNA。提取好的DNA溶于TE缓冲液中，-20 ℃保存备用。
1.2 引物选择
与核DNA相比，鱼类线粒体DNA具有分子小、结构简单、易于提取且是母系遗传的特点，
因此线粒体DNA片段常作为分析鱼类种结构、物种分类鉴定的分子标记[16]。迄今为止，国内外学者常选用Cyt b、COⅠ基因或16S rDNA等的片段作为鱼类的识别片段[6-8]。参照国内外文献[11，17-19]，到5对线粒体基因组部分序列的鱼类通用引物，其扩增产物分别属于线粒体Cyt b基因、Cyt b基因、16S rDNA、16S rDNA和COⅠ基因片段。引物均由杭州联川生物技术股份有限公司合成，详见表1。
1.3 PCR扩增及质控
PCR初筛：用选取的5对引物分别对2个水样eDNA进行扩增。25 μL反应体系包括：2.5 μL 10×buffer，2 μL dNTP(2.5 mmol·L-1)，各1 μL正反引物(10 μmol·L-1)，0.15 μL Taq酶(5 U·μL-1)，1 μL DNA模板(约50 ng)，17.35 μL ddH2O。反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，退火40 s(各引物退火温度见表1)，72 ℃延伸1 min，35个循环；71 ℃延伸10 min。扩增后各取5 μL的PCR产物于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电压100 V，电泳60 min，用溴化乙锭染8 min，最后在凝胶成像系统上拍照，并统计每对引物的扩增效果。
PCR验证：依据初筛结果，选取扩增效果良好的引物，分别再对剩余7个eDNA样品进行扩
架桥机
增，反应条件和体系、凝胶成像条件不变，以此验证引物的实际通用效果，每对引物设置1个阴性对照。
1.4 目的片段文库构建、测序及数据分析
使用PCR扩增产物建库，文库构建步骤遵循Illumina测序仪文库构建方法，其中引物序列采用筛选出的能够对环境样品良好扩增的引物。通过2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并采用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收试剂盒对目标片段进行回收。
对纯化后的PCR产物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor 荧光定量系统上对文库进行定量。将合格的上机测序文库(文库浓度≥2 nmol·L-1)梯度稀释后，依据所需测序量按相应比例混合，并经NaOH变性为单链上机测序。测序采用Illumina Miseq平台。测序获得的数据经拆分、拼接和过滤等分析后，得到高质量的序列。应用软件Vsearch 2.3.4对高质量序列在97%的相似性水平上进行聚类，产生可操作性分类单元(operational taxonomic units，OTUs)。以每个OTUs中最长的序列作为代表性序列，通过BLAST在NCBI数据库中查同源序列，将最相近且可信度达到90%以上序列的种属信息，作为该序列的物种注释信息。由于本研究只关注于鱼类多样性的研究，故只标注注释上的
鱼类物种信息。
2 结果与分析
2.1 DNA提取结果
各样本的核酸浓度为321.10～523.3 ng·μL-1，核酸总量为14.09～20.93 μg，符合后续扩增和建库要求。
表1 PCR所用的5对通用引物
Table 1 Five pairs of universal primers for PCR
引物名称Primername扩增区域Region引物序列Sequence(5′-3′)片段长度Size/bp退火温度Tm/℃参考文献ReferenceCYFMCytbTCCTTTTGAGGCGCTACAGT13060[11]GGAATGCGAAGAATCGTGTTCY45MCytbTTCCTAGCCATACAYTAYAC28540[17]GGTGGCKCCTCAGAAGGACATTTGKCCYCA1634M16SrDNAGCCTGTTTACCAAAAACATCAC20250[18,20]CTCCATAGGGTCTTCTCGTCTT16ACM16SrDNACCTTTTGCATCATGATTTAGC33040[18]CAGGTGGCTGCTTTTAGGCCOⅠMCOⅠAGCCCACGCAGGAGCATCAG17150[19]ACGGCGGTTACAAGCACGGA
2.2 初筛扩增结果
分别用5对引物对提取的2个水样eDNA进行PCR扩增，扩增产物的凝胶电泳如图1。引物CY45M在2～3泳道的相似位置出现了相对清晰的条带，该扩增条带长度符合预期长度。引物1634M在4～5泳道的相似位置出现了明亮清晰的条带，且该条带的长度符合预期长度，显示出引物1634M对eDNA具有良好的扩增效果。泳道6～9均未见明显的扩增条带，说明引物16ACM和COⅠM在水样eDNA中无法扩增出目的条带。引物CYFM在泳道10～11上分别有一条暗淡的条带，该条带长度超过1 000 bp，不符合目的条带的预期长度，显示该引物对eDNA的扩增效果不佳。
2.3 验证扩增结果
医用不锈钢选取具有良好扩增效果的引物CY45M和1634M，对剩余7个水样eDNA进行PCR扩增。以9个水样eDNA为模板的扩增产物的凝胶电泳如图2和图3。结果发现，引物CY45M扩增出了所有环境样品中的Cyt b基因片段，目的条带清晰，但是在目的条带下方出现了一条杂带。引物1634M的扩增条带干净清晰，无非特异性条带，无拖带现象。总体来看，2对引物对环境样品的扩增效果均能满足后续的实验要求。
2.4 Illumina测序结果
为进一步验证测序效果，采用Illumina MiSeq测序平台对9个水样eDNA的扩增产物进行高通量测序。CY45M扩增产物测序共获得50 510～136 715条原始序列，优化后获得32 070～76 930条高质量序列，有效数据率为50.69%～71.42%；1634M扩增产物测序共获得36 811～77 604条原始序列，优化后获得35 916～74 557条高质量序列，有效数据率为95.17%～97.75%。所有高质量序列在97%的相似性水平上对其进行聚类，结果引物CY45M共获得3 738个OTUs，而1634M共获得2 305个。
泳道1，GeneRuler 50 bp DNA ladder；泳道2—3，引物CY45M的扩增产物；泳道4—5，引物1634M的扩增产物；泳道6—7，引物16ACM的扩增产物；泳道8—9，引物COⅠM的扩增产物；泳道10—11，引物CYFM的扩增产物。Lane 1， GeneRuler 50 bp DNA ladder; Lane 2-3， PCR products of CY45M; Lane 4-5， PCR products of 1634M; Lane 6-7， PCR products of 16ACM; Lane 8-9， PCR products of COⅠM; Lane 10-11， PCR products of CYFM.图1 五对引物扩增水样eDNA的结果Fig.1 Results of two water DNA samples amplified by the five primers
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