(10)申请公布号 CN 102226216 A
(43)申请公布日 2011.10.26C N 102226216 A
*CN102226216A*
(21)申请号 201110142323.0
(22)申请日 2011.05.30
C12Q 1/68(2006.01)
C12Q 1/04(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
(71)申请人河北省农林科学院植物保护研究所
地址071000 河北省保定市东关大街437号
(72)发明人马平 李社增 郭庆港 鹿秀云
李宝庆
(74)专利代理机构北京众合诚成知识产权代理
有限公司 11246
代理人胡长远
与众不同的麻雀(54)发明名称
的分类方法
(57)摘要
本发明公开了一种用于鉴定芽孢杆菌的通用
精矿粉引物，所述的通用引物由SEQID No ：1所示的核苷
酸序列组成的上游简并引物和由SEQ ID No ：2所
示的核苷酸序列组成的下游简并引物组成。本发
利用通用引物进行PCR 扩增，然后对PCR 扩增产物
进行测序，再利用序列比对软件在Genbank 数据
库中进行序列比对，序列相似性最高的已知菌株
所属的种即为该菌株所属的种。利用本发明通用
引物能将所有的芽孢杆菌进行分类，其分类结果
准确，可靠；其次，本发明通用引物不仅能将芽孢
杆菌在种的水平上进行分类，而且还可进行亚种
水平的分类；此外，本发明分类鉴定方法简单、鉴
定速度快。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 11 页序列表 5 页 附图 4 页
1.用于鉴定芽孢杆菌的基因扩增通用引物，其特征在于所述的通用引物由上游简并引物和下游简并引物组成，所述的上游简并引物由SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成，所述的下游简并引物由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成。 2.利用权利要求1所述的通用引物对芽孢杆菌进行分类鉴定的方法，按照如下步骤进行：
(1)以待测菌株的基因组DNA为模板，以上游简并引物和下游简并引物为引物进行PCR 扩增，对扩增所得的DNA片段进行回收、纯化、测序，得phoPR基因序列；其中所述的上游简并引物由SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成，所述的下游简并引物由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；
(2)将步骤(1)测序所得待测菌株的phoPR基因的核苷酸序列与GeneBank数据库中所有芽孢杆菌的phoP/phoR基因的核苷酸序列进行序列比对，序列比对结果中与待测菌株序列相似性最高的菌株所属的种，即为该菌株所属的种。
3.按照权利要求2所述的分类鉴定的方法，其特征在于其步骤(2)中所述的序列比对是将扩增所得的待测菌株的phoPR基因序列与GenBank数据库中所有的芽孢杆菌的phoP/ phoR基因序列通过BLAST进行序列比对；对比结果中与待测菌株序列相似性最高的芽孢杆菌菌株所属的种，即为该菌株所属的芽孢杆菌的种。
4.利用权利要求1所述的通用引物对芽孢杆菌进行分类鉴定的方法，按照如下步骤进行：
(1)以待测菌株的基因组DNA为模板，以上游简并引物和下游简并引物为引物进行PCR 扩增，对扩增所得的DNA片段进行回收、纯化、测序，得phoPR基因序列；其中所述的上游简并引物由SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成，所述的下游简并引物由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；
(2)利用Clustal X软件对2个以上的未知菌株的phoPR基因序列进行多重序列比对，比对过程中同时加入不同种的标准菌株的phoPR基因序列；然后利用MEGA软件构建系统发育树，在系统发育树中与待测菌株亲缘关系最近的标准菌株所对应的种，即为该菌株所属的种。
5.按照权利要求2、3或4所述的分类鉴定的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的PCR 扩增的反应体系为：10×Buffer 5μl，dNTPs 8μl，phoPR-F1μl，phoPR-R 1μl，待测菌株基因组DNA 1μl，rTaq DNA聚合酶1μl，ddH
O33μl；共50μl。
2
vishnu6.按照权利要求5所述的分类鉴定的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的PCR扩增的反应条件为：95℃ 5min；94℃ 45s，48℃ 45s，72℃ 1min，共35个循环；72℃ 10min。
7.一种芽孢杆菌分类鉴定试剂盒，其特征在于含有由SEQ ID No：1和SEQID No：2所示的核苷酸序列组成的基因扩增通用引物。
8.按照权利要求7所述的芽孢杆菌分类鉴定试剂盒，其特征在于还包括dNTPs、10×Buffer、rTaq DNA聚合酶和超纯水。
用于鉴定芽孢杆菌的通用引物以及使用它们的分类方法
技术领域
[0001] 本发明属于芽孢杆菌鉴定分类方法。具体涉及用于鉴定芽孢杆菌的通用引物，以及利用它们对芽孢杆菌进行分类鉴定的方法
背景技术
[0002] 芽孢杆菌(Bacillus)是一类广泛存在于自然界、能形成芽孢的革兰氏阳性细菌。不同种类的芽孢杆菌对人类的作用是不同的，有些是有益的，如某些枯草芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌可以产生用于作物病害生物防治的抑真菌物质，地衣芽胞杆菌可以产生工业所需的酶类，苏云金芽孢杆菌(BT)可以产生可作为微生物杀虫剂的毒性蛋白。而有些则是有害的，如芽胞杆菌能引起人类致死的病；蜡样芽孢杆菌可以污染食品从而引起人类腹泻。因此，在应用之前对于芽孢杆菌进行准确分类十分重要。
[0003] 芽孢杆菌属(Bacillus)中的有些种之间亲缘关系较近，形态特征相似，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)，短小芽孢杆菌(B.pumilus)，巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，坚强芽孢杆菌(B.firmus)，蜡样芽孢杆菌(B.cereus)，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)或芽胞杆菌(B.anthracis)等(Porwal等.PLoS One2009(4)，4438)，利用现有方法有时难以进行准确区分。
[0004] 芽孢杆菌的分类鉴定方法主要有：(1)形态和生理生化方法，此种方法因不同芽孢杆菌种之间形
态和生理生化特征比较相似而难以对它们进行区分，存在准确度不高、费时费力等缺点(Ash，C等.Letters in Applied Microbiology.1991.13，202-206)。(2)16S rDNA序列对比方法，由于不同种的芽孢杆菌之间16S rDNA序列相似性极高(＞98％)，对有些芽孢杆菌很难进行准确地归类。(3)RAPD和AFLP扩增标记对比方法，此方法均存在操作复杂或分类结果不准确的缺点(Levy，H.等.(2010).The Challenge of Highly PathogenicMicroorganisms 191-198.Tourasse，N.J.等.(2010).FoodMicrobiology)。
(4)利用gyrA、gyrB或rpoD基因等芽孢杆菌中普遍存在的、序列变异程度较高的基因进行鉴定分类(Chelo，I.M.等.International journal of systematicand evolutionary microbiology.2007.57，276。Meintanis，C.等.Letters in applied microbiology.2008.46，395-401)。其中gyrB基因已被广泛地用于芽孢杆菌的系统发育分析和菌株鉴定(Bavykin，S.G.等.Journal of Clinical Microbiology.2004.42，3711)，但该基因不能准确地将苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)和蜡样芽孢杆菌区分(B.cereus)(Wang，L.T.等.International journal of systematic and evolutionarym icrobiology.2007.57，1846)。从上述可知，到目前为止，还没有一种能将所有的芽孢杆菌种区分的方法，导致有些芽孢杆菌种之间难以区分，限制了有益芽孢杆菌的应用或对有害芽孢杆菌缺少明确的认识。
[0005] phoR和phoP(亦表示为：phoP/phoR)是芽孢杆菌中普遍存在的一个双因子调控系统，其中phoR基因全长1737bp，编码一种组氨酸蛋白激酶，phoP基因全长720bp，编码一种
受体蛋白，两个基因之间存在8bp的重叠序列。在低磷环境下，phoR自身磷酸化并且将获得的磷酸基团转移到phoP上，磷酸化的phoP调控下游基因的表达。
发明内容
[0006] 本发明人从枯草芽孢杆菌NCD-2菌株中克隆出phoP和phoR基因，在进行序列比对时意外发现，在芽孢杆菌属内不同种的菌株之间phoP/phoR双因子调控系统基因序列(指phoP和phoR两个基因的全序列)存在较高的变异性，因此，本发明人提出将phoP/phoR 双因子调控系统内部的部分核苷酸序列用于芽孢杆菌的鉴定分类，本发明中用“phoPR”或“phoPR基因”来表示所述的phoP/phoR双因子调控系统的部分核苷酸序列。
[0007] 本发明目的在于提供一种用于鉴定芽孢杆菌的基因扩增通用引物。
[0008] 本发明另一目的是提供利用上述基因扩增通用引物对芽孢杆菌进行分类鉴定的方法。
[0009] 本发明第三目的是提供含有上述基因扩增通用引物的芽孢杆菌分类鉴定试剂盒。[0010] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
萨维切维奇
[0011] 本发明用于鉴定芽孢杆菌的基因扩增通用引物，所述的基因扩增通用引物由上游简并引物phoPR-F和下游简并引物phoPR-R组成，所述简并引物的核苷酸序列为：[0012] phoPR-F：5’GG(G/
C/T/A)TA(T/C)AAA(A/T/C/G)A(G/A)GAGGAGCC 3’(SEQID No：1)，
[0013] phoPR-R：5’TT(C/T)A(G/A)(C/T)TCATG(A/G)GA(A/C/G)ACATT 3’(SEQ IDNo：2)。[0014] 上述用于鉴定芽孢杆菌的基因扩增通用引物中所述的基因扩增可以是PCR扩增。[0015] 利用上述基因扩增通用引物对芽孢杆菌进行分类鉴定的方法，按照如下步骤进行：
潘海东[0016] (1)以待测菌株的基因组DNA为模板，以上游简并引物phoPR-F和下游简并引物phoPR-R为引物进行PCR扩增，对扩增所得的DNA片段进行回收、纯化、测序；其中所述的简并引物为：
[0017] phoPR-F：5’GG(G/C/T/A)TA(T/C)AAA(A/T/C/G)A(G/A)GAGGAGCC 3’(SEQID No：1)；
[0018] phoPR-R：5’TT(C/T)A(G/A)(C/T)TCATG(A/G)GA(A/C/G)ACATT 3’(SEQ IDNo：2)；[0019] (2)将步骤(1)测序所得待测菌株的phoPR基因的核苷酸序列与GeneBank数据库(美国国立生物技术信息中心(Nat ional Center for BiotechnologyInformation，简称NCBI)，网址：bi.v/guide)中所有芽孢杆菌的phoP/phoR基因的核苷酸序列进行序列比对，序列比对结果中与待测菌株序列相似性最高的菌株所属的种，即为该菌株所属的种。
[0020] 上述分类鉴定的方法步骤(2)中所述的序列比对结果，如果该菌株和某一菌株的序列相似性为100％，那么可能是相同菌株；如果序列相似性不是100％，就属于新菌株。[0021] 上述分类鉴定的方
法步骤(1)中所述的PCR扩增，按照本领域技术人员熟知的方法进行，其反应体系为：10×Buffer(+Mg2+)5μl，dNTPs 8μl，phoPR-F1μl，phoPR-R 1μl，待测菌株基因组DNA(约10ng)1μl，rTaq DNA聚合酶1μl，ddH
O 33μl；共50μl。
2
[0022] 上述分类鉴定方法步骤(1)中所述的PCR扩增，按照本领域技术人员熟知的方法
进行，其PCR反应条件为：95℃5min；94℃45s，48℃45s，72℃1min，共35个循环；72℃10min。
[0023] 上述分类鉴定的方法步骤(2)中所述的序列比对是将扩增所得的待测菌株的phoPR基因序列与GenBank数据库中所有的芽孢杆菌的phoP/phoR基因序列通过BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)进行序列比对；对比结果中与待测菌株序列相似性最高的菌株所属的种，即为该菌株所属的芽孢杆菌的种。
[0024] 上述分类鉴定的方法步骤(1)中所述的PCR扩增的DNA片段的回收和测序，按照本领域技术人员熟知的方式，将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，然后纯化、回收扩增所得的目的片段；将回收的目的片段连接到pEASY-T质粒载体上，再热击转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，选择白菌落，并以M
13/RV-P为引物，通过PCR方法对白菌落进行验证，如果通过PCR方法能获得大约1.5kb的扩增片段，则该白菌落为正确的菌落；挑选经过验证的菌落送交专业测序公司进行测序。所述的引物为：
[0025] M13：5’cgacgttgtaaaacgacggccagt 3’(SEQ ID No：3)
[0026] RV-P：5’ggaaacagctatgaccatgattac 3’(SEQ ID No：4)
[0027] 在应用上述分类鉴定方法之前，也可以首先对待测菌株进行形态鉴定、生理生化鉴定或者16s rDNA序列分析等，确定其是否为芽孢杆菌；在确定为芽孢杆菌后，再利用phoPR基因序列进行分类。
[0028] 上述分类鉴定的方法步骤(2)中，还可利用Clustal X软件对2个以上的未知菌株的phoPR基因序列进行多重序列比对，比对过程中同时加入不同种的标准菌株的phoPR 基因序列；然后利用MEGA软件构建系统发育树，在系统发育树中与待测菌株亲缘关系最近的标准菌株所对应的种，即为该菌株所属的种。
[0029] 所述的不同种的标准菌株的phoPR基因序列可通过上述PCR方法扩增、测序获得；亦可通过直接在Genbank数据库中选择相应的标准菌株的序列。
[0030] 所述的Clustal X软件是用于多序列比对的软件。Clustal X软件可从互连网上下载。
[0031] 所述的MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)是研究分子进化遗传分析的软件，用于序列比对、进化树的推断、估计分子进化速度、验证进化假说等。MEGA软件可从互联网上下载。
薯蓣丸加减[0032] 上述分类鉴定方法步骤(1)中所述的待测菌株基因组DNA的提取，可以按照本领域技术人员熟知的方法进行，如碱裂解及苯酚-氯仿抽提法((参见Beyer 等.Microbiological research.1995，150：179)。
[0033] 一种芽孢杆菌分类鉴定试剂盒，含有由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成的基因扩增通用引物。该引物可用于进行PCR扩增。
[0034] 按照本领域技术人员熟知的方式，上述芽孢杆菌分类鉴定试剂盒还包括dNTPs、10×Buffer、rTaq DNA聚合酶和超纯水。
[0035] 所述的基因扩增通用引物phoPR-F和phoPR-R由人工合成。
[0036] 同现有的芽孢杆菌的鉴定方法相比，本发明具有以下优点：(1)利用本发明通用引物进行扩增所得的DNA片段多态性非常丰富，通过它们对芽孢杆菌进行分类鉴定，能将所有的芽孢杆菌菌株进行分类，其所得分类结果准确，可靠性高；(2)本发明通用引物不仅
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