熊向英;蔡小辉;彭银辉;黄国强;梁志辉;王志成
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【摘 要】[目的]快速、准确地检测卵形鲳鲹(Trachinoms ovatus)感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和格式乳球菌(Lactococcusgarvieae)4种主要的致病菌,为卵形鲳鲹的健康养殖提供依据.[方法]针对4种致病菌的特异基因设计特异性引物cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R,建立多重PCR反应体系,通过调试各引物对之间的最佳比例以及最适退火温度,对反应体系进行优化及灵敏度测试.2014年6～8月,应用该体系对北海及湛江各养殖场的发病卵形鲳鲹进行检测,然后用通用引物扩增16S rRNA基因,经测序、比对检测体系的准确性.[结果]反应体系中cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R的最适浓度分别为0.2 μmol/L,0.08 μmol/L,1.6 μmol/L和0.4 μmol/L;最优退火温度为54.3℃;4种目标菌的检测灵敏度为5×10-2 ng/μL;11份病原样品检测中,2份出现海豚链球菌的目的条带,4份出现无乳链球菌的目的条带,5份未见目的条带,和测序分析结果一致.[结论]多重PCR方法能代替传统的微生物检测方法特异、快速、灵敏地检测4种致病菌.
【期刊名称】《广西科学》
【年(卷),期】2016(023)001
【总页数】6页(P35-40)
【关键词】多重PCR;链球菌病;无乳链球菌停乳链球菌;格式乳球菌;海豚链球菌
【作 者】熊向英;蔡小辉;彭银辉;黄国强;梁志辉;王志成
【作者单位】广西海洋研究所,广西海洋生物技术重点实验室,广西北海536000;广西海洋研究所,广西海洋生物技术重点实验室,广西北海536000;广西海洋研究所,广西海洋生物技术重点实验室,广西北海536000;广西海洋研究所,广西海洋生物技术重点实验室,广西北海536000;广西海洋研究所,广西海洋生物技术重点实验室,广西北海536000;广西海洋研究所,广西海洋生物技术重点实验室,广西北海536000民用机场管理条例
【正文语种】中 文
【中图分类】S941
【研究意义】随着水产养殖业的快速发展,链球菌(Streptococcus)导致的疾病频繁暴发,并在世界范围内造成重大经济损失。迄今为止，链球菌病的主要致病菌包括副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、格式乳球菌(Lactococcus garvieae)、Lactococcus piscium、鲑鱼漫游球菌(Vagococcus salmoninarum)、栖鱼肉杆菌(Carnobacterium piscicola)[1-4]。1957年日本在养殖虹鳟鱼(Oncorhychus mikiss)上发现链球菌病，这是最早发现的鱼类链球菌感染性疾病[5]。20世纪80年代以后，已有多个国家报道了鱼类链球菌病的暴发与流行，包括尼罗罗非鱼(Tilapia nilotica(linnaeus))、 尼罗尖吻鲈(Lates niloticus)、大菱鲆(Psetta maxima)、卵形鲳鲹(Trachinoms ovatus)、黄狮鱼(Seriola quinqueradiata)、红鼓鱼(Sciaenops ocellatus)、海鲷(Sparus auratus)、日本比目鱼(Paralichthys olivaceus)[6-15]。而在中国，养殖罗非鱼(Oreochromis speices)的链球菌发病率为20%～50%，死亡率为50%～70%，甚至更高,链球菌病已严重危害中国罗非鱼养殖业的健康发展[16]。近年来，卵形鲳鲹凭借其肉质具有鲹类特殊鲜味、生长速度快、出口加工市场前景诱人等特点，养殖规模一度呈倍数增长态势[17-18] 。然而由于卵形鲳鲹主要养殖模式是采用高密度的近海网箱养殖，随着该养殖产业的快速发展和无序扩张，海区负
荷过大，养殖环境不断恶化，导致卵形鲳鲹细菌性病害暴发日益频繁。【前人研究进展】2007年，周素明等[19]首次从卵形鲳鲹上分离到停乳链球菌，随后在2014年，黄婷等[20]从患病的卵形鲳鲹上同时分离到无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌。本实验室于2012-2014年针对卵形鲳鲹进行流行病学调查，陆续从北海、湛江、深圳、珠海等地分离到无乳链球菌、停乳链球菌、格式乳球菌和海豚链球菌，发现链球菌的分离频率不断增加，这表明链球菌病已成为威胁卵形鲳鲹健康养殖的主要病原之一。【本研究切入点】目前采用的生化反应、药敏试验和电镜观察等传统的诊断方法耗时费力，因此有必要开发一种经济有效的,能快速检测出卵形鲳鲹感染链球菌情况的诊断技术。【拟解决的关键问题】建立一个多重PCR体系，旨在快速、准确地检测无乳链球菌、停乳链球菌、海豚链球菌和格式乳球菌4种主要的致病菌，为卵形鲳鲹的健康养殖提供依据。
实验用阳性对照的4种菌株(表1)：停乳链球菌和格式乳球菌由中国水产科学研究院南海水产研究所徐力文副研究员惠赠。无乳链球菌和海豚链球菌为本实验室-20℃保存。
病原菌菌株(表2)：2014年6～8月在北海和湛江两地采集临床症状有食欲不振、昏睡、眼球突出、眼角膜混浊等的患病卵形鲳鲹11份,无菌条件下，分别取患病卵形鲳鲹的脑、肝脏、
脾脏和肾脏组织接种于血平板上，于30℃下恒温培养24～48 h，挑取优势单菌落在血平板上再次划线分离纯化。
将实验菌株接入BHI液体培养基中，于33℃恒温摇床220 r/min振荡培养24～48 h后,按照MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit试剂盒(TaKaRa,Japan)说明书提取细菌基因组DNA，提取后保存至-20℃备用。
依据无乳链球菌的特异性基因cfb的序列，停乳链球菌的特异性基因tuf的序列，海豚链球菌和格式乳球菌的16S rRNA序列设计4对引物(表3)，由广州英潍捷基有限公司合成。
25 μL反应混和液内含1.0 μL模板DNA,1.5 mmol/L MgCl2,0.4 mmol/L dNTPs,1 U TaqDNA 聚合酶,2.5 μL 10×PCR缓冲液。多重PCR反应条件：94°C 预变性5 min;94°C变性35 s,55°C 退火40 s,72°C延伸45 s，32个循环;72°C延伸10 min。PCR扩增产物在1.0% 琼脂糖凝胶进行电泳,溴化乙锭染,紫外线下观察、拍照。用胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收纯化目的PCR扩增产物，由广州英潍捷基有限公司完成测序。
通过调整4对引物之间的比例以及退火温度的梯度变化(48.0℃、49.3℃、51.8℃、54.3℃、57.0℃、58.6℃)，从中优化出最适条件。
数字监控系统
将提取备用的4种检测菌株的基因组DNA分别稀释为8×10-1 ng/μL、 4×10-1 ng/μL、 2×10-1 ng/μL、1×10-1 ng/μL、5×10-2 ng/μL，按照已优化的多重PCR反应条件进行PCR扩增，测定其灵敏性。
1.2.6 多重PCR对临床样品的检测
我国拟立法禁止暴力伤医将从自然发病的卵形鲳鲹中分离纯化到的病原菌接种于BHI液体培养基中，扩大培养后提取病原菌基因组DNA后，利用优化的多重PCR体系检测。为验证多重PCR的结果，用通用引物27 F (5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′)和1492 R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增16S rRNA基因。PCR产物测序由广州英潍捷基有限公司完成，将所得序列在Genebank 中进行比对分析。
对比测试4对引物之间的比例，结果显示当多重PCR的反应体系中分别加入0.2 μmol/L引物cfb-F/cfb-R，0.08 μmol/L引物tuf-F/tuf-R，1.6 μmol/L引物Si-F/Si-R和0.4 μmol/L引物PLG-F/PLG-R，即比例为1∶0.4∶8∶2时，4条PCR产物能同时扩出来。如图1所示，退火温度为54.3℃时各条带亮度均匀，没有非特异条带产生，说明54.3℃为最佳退火温度。德庆公社
对多重PCR反应体系进行灵敏度检测，结果显示最低检测浓度为5×10-2 ng/μL(图2)。
如图3所示，多重PCR成功扩增出海豚链球菌的特异条带1 391 bp 2条，无乳链球菌的特异条带470 bp 4条，其余5份样品未见目的条带。所有菌株的16S rRNA基因PCR产物经测序、比对相似性分析表明，分离菌株TS07、TS08与已报道的海豚链球菌(NCBI序列号：KC748467)16S rRNA 基因序列相似性为99%，TS09、TS10、TS11、TS13与已报道的无乳链球菌(NCBI序列号：JQ039375)16S rRNA 基因序列相似性为99%，TS12、TS14与已报道的气囊水栖菌Enhydrobacter aerosaccus(NCBI序列号：KF013200)16S rRNA 基因序列相似性为99%，TS15、TS16与已报道的副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus(NCBI序列号：CP006008),TS17与已报道的创伤弧菌Vibrio vulnificus(NCBI序列号：CP009261)16S rRNA 基因序列相似性为100%。
1，13：4K DNA Marker;2：TS07；3：TS08；4:TS09；
山东建筑大学高鹏
由于传统鉴定致病菌的生化反应、药敏试验和电镜观察等诊断方法耗时、费力，建立一个快速、经济、灵敏的诊断技术能有效得防止疾病的暴发。Henegariu等[25]认为多重PCR体系构建成功的关键在于各引物对之间的相对浓度、PCR缓冲液的浓度、氯化物和dNTPs之间的平衡以及循环的温度。多数学者[26-28]则认为多重PCR体系的优化主要为改变退火温
度、MgCl2、dNTPs和聚合酶的浓度等。Panangala等[29]建立多重PCR时通过调整引物之间的浓度，其中最高浓度引物是最低浓度引物的1.5倍。本研究中，通过预试验显示多重PCR体系构建成功关键参数为4对引物之间的比例和退火温度，其中海豚链球菌的特异基因最难扩增。因此，在反应体系中大幅度提高了海豚链球菌引物Si-F/Si-R的浓度，使得引物Si-F/Si-R的浓度是tuf-F/tuf-R的20倍；此外，当退火温度为54.3℃时，可避免目的条带不均匀扩增，非特异性条带的出现，确定54.3℃为最佳退火温度。
3对引物cfb-F/cfb-R,PLG-F/PLG-R,Si-F/Si-R的特异性在之前的文献中都用系统进化相关菌进行过验证[21，24，30]，均未扩增出相关条带，而tuf基因能够区分分类关系上即使是最相近的链球菌种[22]，所以本研究并没有对该多重PCR体系进行特异性验证。本实验最低能够检测到5×10-2 ng/μL 的基因组DNA模板的质量浓度，这和其他学者的研究结果类似，比如鳗弧菌Vibrio anguillarum的最低检测浓度为50 pg，海豚链球菌、无乳链球菌、副乳房链球菌、格式乳球菌为12.5～50 pg[30-31]，因此，本实验的灵敏度能够达到对链球菌病诊断的需求。
另外，为了验证多重PCR的可靠性，本实验用通用引物扩增其16S rRNA基因，产物测序
后经过比对证明。值得注意的是，结果显示同一条鱼上的不同组织可能感染不同的细菌，这与黄婷等[20]报道从发病卵形鲳鲹上首次同时分离到无乳链球菌和海豚链球菌的结果一致，但是传统观念认为一条鱼只能感染一种细菌，这可能与不同组织的感染途径不同有关，有待于进一步进行深入研究。
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