令孩子惊奇的72个科学异想刘军;赵良杰;凡迎春;张新磊;刘其根
【摘 要】hbv疫苗为了筛选一个通用性和适用性良好的能够运用于环境DNA（ eDNA）研究的鱼类引物，从相关文献中选取了鱼类线粒体基因组部分片段的5对引物，分别对线粒体D-loop区、16S rRNA基因、 COI基因以及Cytb基因部分片段进行扩增。对千岛湖48种鱼类基因组DNA进行扩增后比较发现，引物16 s和COI均可以取得良好的扩增效果，通用性优于其他几对引物。引物16s的扩增产物经凝胶电泳检测均出现明亮的目的条带，引物COI则有3种鱼的条带经凝胶电泳检测亮度较暗。利用上述引物对环境样品eDNA扩增时发现，只有16s和COI的引物具有良好的扩增效果，能够得到明显单一的亮带。对该两种引物的PCR产物克隆后测序比对发现，16s的PCR产物均为千岛湖常见鱼类物种的基因片段， COI的PCR产物则为细菌COI基因的部分片段。综上，我们认为引物16s在通用性和适用性上都更为适合作为鱼类落结构eDNA研究的通用引物。%In order to screen the primer of well universality and applicability for eDNA research, five pairs of universal primer of fish mitochondrial genome fragment were chosen from the previous references to amplify the partial sequences of D-loop region, 16S rRNA gene, COI gene and Cytb gene.These primers were used to amplify genome of 48 species of fish in Qiandao Lake to test the universality, it was found that the 16s and COI were better than the other primers.Gel e-lectrophoresis showed that all 16s DNA bands of the 48 species of fish was light, but 3 COI gene bands of the fish species was dark.The eDNA from Qiandao Lake were amplified by these five pairs of primer, and the electrophoretogram showed that the PCR product of 16s DNA and COI gene presented a clear bright band.According to the cloned sequencing and BLAST results, the PCR product of 16s DNA was coincident to the fragments of fishes from Qiandao Lake, but the PCR product of COI gene was in accord with the COI gene of bacteria.In summary, the primer of 16S rRNA was the most suit-able universal primer to study on eDNA of fish community structure in the Qiandao Lake.
【期刊名称】《淡水渔业》
【年(卷),期】2016(046)001
【总页数】9页(P9-17)
【关键词】引物筛选;线粒体标记;环境DNA;千岛湖
【作 者】刘军;赵良杰;凡迎春;张新磊;刘其根
【作者单位】上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306;上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306;上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306;上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306;上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306
【正文语种】教师的人格魅力中 文
【中图分类】S917.4
环境DNA(eDNA)是指从有机体脱落释放进入到自然环境中(如空气、水、土壤等)的DNA，包括细胞中的DNA和细胞破碎后游离出细胞外的DNA分子。eDNA技术就是直接从水、土壤、沉积物等环境样本中提取DNA片段后通过DNA测序和qPCR等分子生物学检测技术来定性或定量目标生物，从而确定目标生物在该环境中的分布及功能特征的研究方法[1-2]。目前eDNA在生态学方面的应用主要包括对物种多样性的研究[3]、动物食性分析[4]、入侵
及稀有物种调查以及生物量和分布的估测[5-7]。eDNA在水生动物方面的应用在国外已见一些文献报道[8-9]，特别是在鱼类稀有种和入侵种的监测以及生物量估测方面eDNA技术显示出了较传统方法更简单、快捷、灵敏和低成本的诸多优点。
但是，对于鱼类落结构的eDNA研究还需要寻求到一个通用性和适用性都比较理想的通用引物。通过通用引物对于环境样品的有效扩增，利用克隆测序、二代测序以及凝胶电泳等方案，分析鱼类落多样性的分子生物学信息。在以往关于鱼类通用引物的研究中，研究者往往只是考虑提供扩增单一鱼类DNA模板的通用性引物，因为模板DNA中没有其他生物来源的DNA组分，因此只需要考虑引物的通用性[10-11]；而环境样品的组分是复杂的，这就要求引物的通用性是适中的：即需要对于不同的鱼类物种具有通用性，又需要对于鱼类物种的扩增具有一定的特异性，不能扩增或者过多的扩增出其他物种的目的条带。另外运用eDNA对鱼类进行研究，几乎都是在欧美或者日本开展的[6,8,12]，由于鱼类区系的差异，我国是一个以鲤科为主要类的国家[13]，水域生态系统中主要鱼类组成为鲤科鱼类，因此国外研究中提供的鱼类通用引物的通用性和适用性也有待论证。
每个人的战争为了寻求一个eDNA鉴定鱼类落结构的通用引物，我们选择在千岛湖开展鱼类eDNA通用
引物的筛选验证。该水库鱼类物种数多[14]，不仅分布有鲤科绝大部分类，而且存在例如斑点叉尾 (Ietaluruspunetaus)、蓝鳃太阳鱼(Lepomismacrochirus)等外来物种以及间下 (Hyporhamphusintermedius)、虾虎鱼属(Gobiidae)、鳜属(Siniperca)等海源性淡水鱼类，鱼类区系可以很好地代表我国东部地区淡水水域的鱼类组成情况，因此，是一个开展此种研究的理想的生态系统。另外，该水库水下环境复杂，使用传统的捕捞方法对千岛湖进行鱼类落和多样性调查难度大、耗费高。而对于千岛湖鱼类落结构和多样性的了解，对于该水体渔业增殖管理也有着重要的指导意义，基于eDNA的技术优势，也极为有必要开展对于千岛湖鱼类落结构和多样性的eDNA研究。因此，本研究选择了文献中提供的若干对线粒体部分序列的通用引物，对这些引物在千岛湖地区的鱼类和环境样品的通用性和适用性进行了探讨，以期能够为千岛湖甚至东亚地区水域的鱼类多样性的eDNA研究提供参考。
1.1 样品采集和DNA提取
2014年7月在千岛湖通过刺网捕捞、向渔民收购，收集鱼类48种(见附录)，保存在无水乙醇中，使用改进的酚氯仿法[15]从鱼类肌肉组织中提取基因组DNA。同时在千岛湖上游库区
随机选取10个点采集水样，每份样品1 L，放入带冰的保温箱中带回千岛湖发展有限公司水科所实验室，24 h内对水样进行抽滤处理，使用滤膜孔径为1.2 μm，使用QIAGEN公司生产的试剂盒QIAamp DNA Micro Kit提取滤膜中的环境DNA。提取好的DNA溶于TE缓冲液中，-20 ℃保存备用。
1.2 实验引物的选择
鱼类线粒体DNA与核DNA相比具有分子小、结构简单、易于提取且是母系遗传的特点，因此选择线粒体DNA片段作为分析鱼类种结构、物种分类鉴定的分子标记[16]。参照文献[17-21]到5对线粒体序列的鱼类通用引物，由上海生工生物工程有限公司合成，见表1。
1.3 PCR扩增及电泳
使用选取的5对通用引物分别对鱼类DNA和环境DNA进行扩增，反应条件和体系见表2。 扩增后对PCR产物进行凝胶电泳检测，各取5 μL的PCR产物于1%的琼脂糖凝胶中，电压100 V，电泳60 min，用溴化乙锭染8 min，最后在凝胶成像系统上拍照，并统计每对引物的扩增效果。
1.4 克隆测序
挑选出对鱼类样品和环境样品都能够良好扩增的引物，再随机挑选环境样品的扩增产物进行切胶克隆测序，然后通过GENBANK进行Blast比对，以验证环境样品中扩增出来的产物是否为鱼类序列。克隆方法参见《Molecular Cloning:A Laboratory Manual-IV》[22]。
氢氰酸2.1 鱼类样品的扩增结果
领导科学与领导艺术按照1.3中的反应体系和条件分别用5对引物对提取的48种鱼类DNA进行PCR扩增，扩增产物的凝胶电泳图像如图1-图5。
引物16s对鱼类样品的扩增结果显示，1-48泳道都在同一位置出现了明亮清晰的条带，各条带亮度均一(见图1)，显示出引物16s对全部48种鱼类都有良好的扩增效果。引物COI也能够对全部48种鱼类的基因进行扩增，且没有非特异性的杂带，其中15、17、21、22、30、33、40、42、45九个泳道上的条带亮度和其他泳道条带相比较暗，特别是15、22、42三个泳道上的条带明显暗淡(见图2)，这3个泳道对应的鱼类分别是斑点叉尾、鲇(Silurusasotus)和泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)，暗示引物COI对这三种鱼类的扩增效
率较其它种类低下。引物Cytb1对鱼类样品的扩增结果显示，28、30、45三个泳道上没有任何条带，其他泳道上出现预期的条带，但条带亮度不均一，且在目的条带的上方出现一条较暗的非特异性条带(见图3)，说明在此条件下引物Cytb1无法对银鱼(Protosalanxhyalocranius)、 (Hyporhamphussajori)和鳡(Elopichthysbambusa)的基因进行扩增，且对其它鱼类也存在非特异性扩增。引物Cytb4的扩增条带杂乱，非特异性条带多，引物二聚体明显，同时部分泳道没有条带(见图4)，暗示在该条件下Cytb4不适合作为扩增鱼类基因的通用引物。引物D-loop的PCR预期产物长度为1 000 bp，是本试验5种扩增产物中最长的，根据凝胶电泳图显示(见图5)，除了泳道27、28、33、41、45没有条带，其余泳道在1 000 bp处都出现扩增条带，在出现条带的泳道中又有26、30、44泳道的条带暗淡，12泳道上的目的条带下方出现一条亮度很强的非特异性条带，在大部分泳道上都有一些暗淡的非特异性条带，推测引物D-loop在此条件下对光倒刺鲃(Spinibarbushollandi)、银鱼、大鳍 (Acheilognathusmacropterus)、乌鳢(Channaargus)和鳡鱼的基因不产生扩增，同时对斑鳜(Sinipercascherzeri)、间下鱵和狗鱼(Esoxreicherti)基因的扩增效果不佳。综上，引物16s对鱼类样品的扩增效果最好，引物COI也能扩增出全部48种鱼类的基因，Cytb1和D-loop对鱼类样品的扩增也具有一定的通用性，而引物Cytb4对鱼类样品扩增的通用性则有待进一步的验证。
将48种鱼类分类统计涵盖6目12科(见附录)，其中鲤形目的鱼类34种占绝大多数，还包括鲇形目、胡瓜鱼目、颌针 鱼目、鲈形目和鲑形目。由表3可知，引物16s和COI对以上6目的鱼类都有扩增，扩增范围最广。引物Cytb1对胡瓜鱼目的银鱼、颌针鱼目的 以及鲤形目中的鳡没有扩增，引物D-loop对胡瓜鱼目中的银鱼、鲑形目中的乌鳢以及鲤形目中的鳡、光倒刺鲃、大鳍 没有扩增，在一定程度上说明引物Cytb1和D-loop的扩增范围较16s和COI的扩增范围小。另外，由于16S rRNA基因多为保守序列，为了验证不同鱼类在该扩增区域的特异性，我们将以上48种千岛湖主要鱼类的16s扩增片段进行了比对，发现这48种鱼类间都存在序列差异，能够保证对千岛湖主要鱼类类进行有效的物种鉴别。
2.2 环境样品的扩增结果
参照鱼类样品扩增的体系和条件，用该5对引物分别对10个环境样品进行扩增，扩增结果如图6。
由图6可知，引物16s扩增出了所有环境样品中的16S rRNA基因片段，且目的条带明亮清晰，但是在Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ泳道上相同的位置出现了一条暗淡的非特异性条带。引物COI的扩增条带干净清晰，无非特异性条带，无拖带现象，但是对I号环境样品没有扩增。
而对鱼类样品有较好扩增效果的引物Cytb1，无法扩增出10个环境样品的中的目的基因。引物Cytb4的扩增结果显示部分泳道在1 500 ~2 000 bp间出现亮带，而Cytb4的目的条带为500 bp，说明该引物对目的基因片段没有扩增。至于引物D-loop的扩增结果显示只有4个环境样品得到了明显扩增，而且杂带较多，无法判断目的条带，对环境样品的扩增效果无法满足后续的实验要求。
2.3 克隆测序结果
结合鱼类样品和环境样品的扩增结果，可知通用引物16s和COI对鱼类样品和环境样品都有较好的扩增效果，目的片段清晰、明亮。为了进一步了解它们扩增的基因片段是否为鱼类片段，将16s和COI的扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行克隆测序。测得序列在GENBANK中进行Blast对比，对比结果显示(见表3)引物16s的扩增产物克隆测序得到15个阳性序列，经比对检测出6条黄尾鲴(Xenocyprisdavidi)序列、5条蓝鳃太阳鱼(Lepomismacrochirus)序列以及细鳞鲴(Plagiognathopsmicrolepis)、蒙古鲌(Chanodichthysmongolicus)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Hypophthalmichthysnobilis)序列各1条，全部为千岛湖常见鱼类。而COI扩增产物克隆测序得到的5条阳性序列，经对比发现均为细菌的细胞素氧化酶第一亚基。
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