一 模板质量问题: 1)模板提取不完整,其中不含你的目的基因,或目的基因含量太低。可以跑个电泳看看提取的DNA,PCR阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果确定是这种问题,可以增加模板量试试,但不一定行得通。 从武侠到玄幻2)模板里面残留某种试剂成份,可能抑制Taq聚合酶的活性,如果是这种情况,可以用试剂盒把模板再纯化一下,或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。 3) 为什么跑电泳会出现拖带呢? 1. 有可能的因为你的电压调的太高了。电泳跟很多因素有关,其中就有一个是电压,在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率,但是要是超到一个临界值反而有害。你可以适当的调低点看看。 2.有时候发现上样量太多的话会有拖带。你看能否回收之后 ,按1:50 或1:100 等稀释后,再当成模板扩一次怎么样。 二 引物问题 1)样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好,而和另一些基因型结合不好。可以换一对更保守的引物试试。祝顺利! 2)普通PCR所用的一对引物中有一个引物加多了,为正常的三倍只要引物特异性比较好,那么不会产生大的影响。如果恰巧是加多的这条引物不是很特异的话,也许会扩出来非特异带。 在制备单链探针时候就采取这样的不对称pcr,没关系的 三 Taq酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。 tap酶种类 高特异性Taq酶 高度特异性地扩增所需的片段是PCR最基本的要求,影响PCR特异性的因素很多,包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等,而高特异性Taq酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程,也为PCR产物快速有效的纯化(PCR产物直接纯化)打下了基础。这类酶最典型的代表是热启动Taq酶。大家都知道,在PCR第一个循环变性之前,有一个升温的过程,引物和模板会有一些非特异性配对,如果这时Taq酶发挥活性,就很容易产生非特异性扩增,由于循环初期模板量非常少,产生的非特异性条带经过后面的指数扩增,就会严重干扰目的片段的扩增,甚至导致特异性条带不能扩出。而热启动Taq酶是必需经过高温才能激活的酶,因此在初始循环的变性之前它没有活性,不会产生非特异性扩增,这就大大提高了PCR扩增的特异性。第一代热启动Taq酶往往直接在Taq酶上做一些修饰,比如用抗体抑制,蜡封等,如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些产品,由于抗体、蜡等异物的掺入,对实验造成一定的影响,也给试验者带来一些不便。新一代的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶,真正实现便利的热启动,代表产品如QIAGEN公司的HotStar系列,无需别的辅助抑制物,也不用担心抑制不稳定,使用起来方便、高效。此外,由于几乎所有的Taq酶产品都带有相应的反应缓冲液,缓冲液的品质也对保证Taq酶特异性扩增起着不可忽视的作用,一般的缓冲液中调节H键作用的盐只有KCl,QIAGEN公司的缓冲体系通过KCl、(NH4)SO4盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性。 此外,热启动的Taq酶也是实现一步法RT-PCR的基础。如QIAGEN公司的OneStep RT-PCR试剂盒,在RT反应较低温度下,Taq酶没有活性,逆转录酶发挥活性;RT反应结束,高温灭活逆转录酶的同时,激活Taq酶,进行PCR反应。另一家公司Epicentre有一种MasterAmpTM Tth DNA聚合酶,本身就具有逆转录酶活性,也可用作RT-PCR。 高保真Taq酶 下游应用为基因筛选、测序、突变检测,分子诊断等等的用户,往往对PCR保真性要求很高,保真性的一个通用标准是错配率,错配率越低保真性越好。普通Taq酶的错配率在2-5X10-5碱基/循环数,而高保真Taq酶错配率可达10-6数量级,大大降低了出错的可能。其原理主要是因为高保真Taq酶具有3'到5'核酸外切酶(Proofreading)的活性,扩增途中如果产生了错配的碱基,它可以将其切掉,从而保证了扩增的准确性。需要提醒用户的是由于此酶具有核酸外切酶功能,往往扩增效率低一些,有的还容易降解引物,且产物一般不宜用TA或UA克隆法克隆。目前市面上主要有两类产品,一类是混合型的高保真酶,将带有Proofreading活性的酶与普通Taq酶(用于提高扩增效率)混合起来,错配率在8-9 X10-6碱基/循环数。Clontech、LTI等公司都有此类产品。如果要求更高的保真度,就要选择单一型的高保真酶,如Stratagene的Pfu,NEB公司的Vent DNA 聚合酶,错配率5.7 X10-5碱基/循环数;QIAGEN公司新推出的ProofStart DNA聚合酶,兼特异性与保真性于一体,其聚合酶及Proofreading活性都为热启动,可避免引物降解,错配率达2-4×10-6碱基/循环数,加上优化的反应体系,可在室温下配置反应液,可进行复杂模板(高GC含量、二级结构)及长片段的扩增,的确是这类酶中的佼佼者。 高耐热性Taq酶 对于有些模板变性温度较高,需要时间较长的用户,可能要求高耐热性Taq酶,这里介绍NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列,两者都是从海底火山口分离出来后克隆的,是普通Taq酶耐热性的三倍以上,前者在95℃半衰期近7小时,100℃近2小时;后者更甚,分别为23小时和8小时。 超长片段扩增Taq酶 对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的用户,可能会用到超长片段的扩增,Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶,Proofreading酶和热启动抗体,对复杂模板可扩增10kb片段,简单模板可达40kb。 adm关于复杂模板的扩增 对于模板结构复杂,如GC含量高(>60%),有二级结构等,普通的Taq酶可能难以延伸下去,加入DMSO等助熔剂可帮助扩增顺利进行,但DMSO有毒,而且用量需要优化。QIAGEN公司的任何一种Taq酶都附有特制的Q-溶液,操作方便、安全,对复杂模板的扩增特别有效。 关于条件的优化 现下很多著名的生物试剂公司都提供优化的缓冲液,如QIAGEN公司的缓冲体系,对温度和Mg2+的耐受性很强,随试剂盒有推荐的操作手册,大大减少了反应条件的优化,如果结合好的引物设计软件和高质量的模板引物,一次成功率极高。但任何东西都不是万能的,如果碰到比较特殊的情况,还需要仔细分析,优化调整。 以上就Taq酶的一些基本分类分别进行了介绍,具体选购时要根据实验需要择其重点,再参照其他参数,才能选到最合适的Taq酶。我们会及时将最新的技术和产品推荐给大家,希望能帮助大家更快更好的达到实验目的。 四.模板浓度过低。 五、.退火温度过高。有可能,可以做个梯度PCR试一下。 六、循环次数过少或延伸时间过短以致目的基因扩增量不够。这个可能性不大。 七、dNTP浓度 低时PCR产率及特异性均增高,适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成2.6μg的DNA(dNTP消耗一半),所以,你不小心多加了4倍的量,会很影响PCR结果,即Taq酶活力要降低20~30%,即底物抑制。 罗口袜八、PCR产物电泳 1.电泳图不清晰,可能电泳缓冲液和制胶缓冲液浓度不准或者脏了吧。换新的电泳缓冲液和制胶缓冲液试试。 marker都出问题说明是你的胶的问题,或者电泳操作的问题。 2. PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。如下图: 其对策有: ①减少酶量,或调换另一来源的酶。 ②减少dNTP的浓度。 ③适当降低Mg2+浓度。 ④增加模板量,减少循环次数。 3.如何获得亮的电泳条带 PCR反应前5个循环可以降低退火温度5°,后面30-35个循环恢复正常退火温度。也可以以第一次PCR的产物作为二次PCR的模板。
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本文发布于:2024-09-24 21:23:41,感谢您对本站的认可!
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