16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析检测主要血流感染病原菌比较 金中淦;葛平;徐蓉;陈蓉;宣瑛;刘学杰;王庆忠
【摘 要】目的 比较细菌16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析在血流感染病原菌检测中的作用.方法 提取临床上血流感染常见的金黄葡萄菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌、屎肠球菌、粘质沙雷菌、宋内志贺菌、产气肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、腐生葡萄球菌基因组DNA,运用16S rRNA、16S-23S rRNA基因进行PCR扩增.扩增产物经测序后在美国国家生物技术中心( NCBI)上进行比对分析,确定菌种.结果 在所分析的19种临床血流感染常见细菌中,16S rRNA基因测序分析可将除粘质沙雷菌外的细菌鉴定到种的水平,但无法完全区分近缘种属；16S-23SrRNA成功鉴定17种细菌,除大肠埃希菌、宋内志贺菌外所有细菌均成功鉴定到单一种的水平.结论 16S-23S rRNA基因可作为血流感染细菌检测较好的分子靶标. 【期刊名称】《分子诊断与杂志》
【年(卷),期】2012(004)003
穿墙记>法拉第筒【总页数】5页(P181-185)
【关键词】16SrRNA;16S-23SrRNA
【作 者】金中淦;葛平;徐蓉;陈蓉;宣瑛;刘学杰;王庆忠
【作者单位】2011年11月13日上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126
【正文语种】中 文
黄业斌
以菌血症和败血症为主的血流感染具有低发生率、高危险性的特点[1]。据报道，美国血流感染的总体病死率可高达14%～63%，但在明确病原菌后采用针对性，其死亡率可降至5%～17%[2～4]。因此及时快速诊断病原菌对合理用药、缩短疗程等具有重要意义。目前临床上血流感染检测主要采用血培养结合病原菌生化鉴定和药敏试验，以细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等表型特征对细菌进行分类鉴定，但这种诊断规程存在周期长、阳性率低等诸多不足。近年来，分子生物学和基因诊断技术的不断发展为血流感
染的检测提供了新的思路。病原菌的基因组较生化指标稳定，通过基因扩增及其后续技术可以快速、准确地检测病原菌。本研究主要针对16S rRNA基因、16-23S rRNA间隔区基因进行PCR扩增，扩增产物经测序分析后在美国国家生物技术中心（NCBI）上进行比对分析，确定菌种，并比较细菌16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析在血流感染病原菌鉴定中的作用。
1.1 实验菌株
实验用病原细菌由上海市临床检验中心微生物室提供，分别为冻干标准菌株金黄葡萄菌（Staphylococcus aureus，ATCC25923）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，ATCC12228）、大肠埃希菌（Escherichia coli，ATCC25922）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis，ATCC29212）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，ATCC49619）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae，TCC13047）；冻干临床分离株鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、洛菲不动杆菌（Acinetobacter lwoff i i）、肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）、化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）、奇异变形杆菌（Proteus mir
abilis）、潘尼变形杆菌（Proteus penneri）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、粘质沙雷菌（Serratia marcescens）、宋内志贺菌（Shigella sonnei）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）。用于对照的白假丝酵母菌为实验室临床分离株。
1.2 仪器与试剂 HB-100型恒温金属浴（杭州博日）、CLASS Ⅱ TYPE B2生物安全柜（美国NUAIRE）、Biofuge-Fresc O高速冷冻离心机（德国Heraeus）、普通PCR仪（ABI 9700）、电泳仪（上海天能）、全自动数码凝胶成像系统（上海天能）、VITEK2全自动细菌分析仪（法国梅里埃）；血琼脂培养基（上海科玛嘉生物技术有限公司）、DNA提取试剂盒（北京天根）、溶菌酶（北京天根）、DNA Marker DL2000（大连TaKaRa）、PCR 引物、Taq酶及PCR相关试剂均购自上海生工生物工程有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株的复苏、培养、鉴定 在冻干菌株管中加入1 mL灭菌生理盐水，混匀后吸取100 μL至血琼脂培养基上进行划线接种，放置于CO2培养箱中35℃孵育24 h。挑取培养好的菌落染镜检，并用VITEK2全自动细菌分析仪进行鉴定。
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1.3.2 细菌DNA的提取 挑取菌落在无菌麦氏管中配成0.5 McF（约1.5×108CFU/mL）细菌悬液，按照天根的细菌基因组DNA提取试剂盒说明提取DNA，用琼脂糖凝胶电泳分析DNA大小。
1.3.3 PCR 扩增 选取通用引物27F和1492[5]作为16S rRNA 基因片段的扩增引物，正向引物的序列：27F（5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），反向引物的序列为：1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR扩增体系为50 μ L：DH2O 38.5 μ L、10×buffer 5.0 μ L、dNTPMix（10 mM each） 1.0 μL、上游引物（20 pmol/μL） 0.5 μL、下游引物（20 pmol/μL）0.5 μL、5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.5 μL、核酸模板4.0 μL。PCR扩增条件：94℃预变性5 min；94℃1 min，55℃ 1min，72℃1 min进行30个循环；72℃延伸7 min。16S-23S rRNA基因正向引物的序列：5'-GGGTGA AGTCGTAACAAGGTA-3'，反向引物的序列为：5'-GGTACTTAGATGTTTCAGTTC-3'，PCR扩增体系除引物外同16S rRNA 基因扩增体系相同。PCR扩增条件：94℃预变性5 min；94℃1 min，57℃30 s，72℃ 45 s，进行30个循环；72℃延伸5 min。PCR反应均用白假丝酵母菌作为阴性对照，灭菌注射用水为空白对照。
1.3.4 琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增产物各取5 μL，分别混合1 μL加样缓冲液于2%琼脂糖凝胶上，用5 μL DNA标志物DL2000作为分子量参照，于1 ×TAE缓冲液中，电压100 V，电泳30 min后（16S-23S rRNA基因PCR扩增产物电泳60 min后）在凝胶成像系统中拍照。
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1.3.5 PCR产物序列分析 PCR产物送上海迈浦生物科技有限公司进行测序分析。16S rRNA基因PCR扩增产物条带单一，可以直接测序；16S-23S rRNA基因产物条带非单一，均先胶回收分离清晰的单一条带后进行测序。测序完成后，将序列在美国国家生物技术信息中心（NCBI）上运用BLAST程序进行比对分析（bi.v/BLAST），鉴定菌种名称。在GenBank中比对，结果同源性超过98%确立为同一种属。
2.1 19种临床常见细菌提取核酸结果见图1。
2.2 19种临床常见细菌的16S rRNA 、16S-23S rRNA基因PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果见图2。
测序所得的19 种病原细菌16S rRNA、16S-23S rRNA基因PCR 产物的序列在NCBI网站上进行BLAST程序比对后，取序列同源性超过98%的细菌作为鉴定结果。16S rRNA、16S-23S rRNA基因PCR产物测序结果分析见表1。
目前临床细菌主要依靠培养和生化等表型特征进行分类鉴定，然而普通培养多需要48 h以上，而药物敏感试验结果需要72 h以后才能发给临床，极大限制了临床检验结果的应用。血液感染通常进展迅速，临床医生通常在检验结果发出之前进行经验用药，而大量广谱药物的使用令细菌耐药率逐步上升，对后续影响较大。随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定已逐步进入分子水平。常见的是基于16S rRNA基因设计通用引物，通过对PCR产物进行杂交、测序、多态性分析等进行病原菌的鉴定[6]。基于特异性基因有多重（Multiple）PCR技术，且运用寡核苷酸阵列能同时对多个基因序列进行分析。采用多对引物的多重PCR虽然能同时鉴定多个细菌，但是其鉴定的细菌种类是有限的，而且多对引物会使扩增结果复杂，导致敏感性降低和假阳性。相比较而言，运用细菌通用引物进行扩增后测序的方法不失为较好的选择。本研究选取了临床血流感染较常见的19种细菌[7，8]，对细菌16S rRNA、16S-23S rRNA基因运用通用引物进行分析，探讨其在血流感染病原菌鉴定中的作用，为临床血流感染的检测提供实验依据。
16S rRNA基因编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16S rRNA），长度约为（1550 ±200） bp。其序列包含10个可变区和11 个恒定区，可变区因细菌而异，变异程度与细菌的系统发育密切相关[9]。16S rRNA基因作为细菌的“活化石”，常被选作为细菌分类和鉴定的基因，
但对某些细菌而言种间差异较小，分辨力有限。即使表型容易区分的细菌也有着相同的16S rRNA基因序列（如大肠埃希菌与宋内志贺菌、杆菌与蜡样芽胞杆菌）[10]，这就限制了16S rRNA基因序列分析在临床上的广泛应用。Mignard等[11]用30个月的时间运用16S rRNA基因测序方法研究了683株临床分离细菌，其中568株（83.1%）鉴定到种的水平，108株（15.8%）仅鉴别到属的水平，另外7株（1%）尚未能运用16S rRNA基因序列进行鉴定。我们的研究结果表明，由于16S rRNA基因的高度保守性，对相似率极高的近缘种属无法区分，如表皮葡萄球菌与头状葡萄球菌、山羊葡萄球菌、沃氏葡萄球菌；阴沟肠杆菌与肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌与志贺菌属及其亚种等细菌的鉴定仅依赖16S rRNA基因序列是不够的。
16S-23S rRNA基因是位于16S rRNA基因与23S rRNA基因之间的区间序列，具有高度变异及相对保守性，近年来被认为是细菌鉴定的合适部位[12]。研究已经证实16S-23S rRNA基因区间的进化率要高于16S rRNA基因10倍。因此，16S-23S rRNA基因区间具有更适合区分不同细菌的特点，它不但可以用于菌种间的鉴别，还可以用来分辨16S rRNA基因不能鉴别的非常接近的菌种和种内菌株[13，14]。Massonet等[15]运用16S-23SrRNA基因通用引物成功鉴定临床呼吸道感染常见的包括假单胞菌属、葡萄球菌属、肠杆菌科、巴斯德菌
科等在内的22种病原菌。Zhu等[16]的研究表明16S-23S rRNA基因分析可以将16S rRNA序列同源性达97%的两株粘质沙雷菌区分开。我们运用16S-23S rRNA基因扩增后测序的方法可以将所研究的17种细菌成功地鉴定到单一菌种，仅大肠埃希菌与志贺菌属未能区别开。我们的研究结果显示，不同种属细菌16S-23S rRNA 间区的拷贝数、长度和碱基序列存在差异，相比于16S rRNA 基因具有更强的种特异性。
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