园林建筑的空间美感李桂林;宋雅迪;吕振晖;刘春晖;李佳;张夏楠
【摘 要】目的:基于ITS序列建立酸枣仁及其市场混伪品的分子鉴定方法.方法:收集酸枣仁及其常见混伪品理枣仁、枳棋子、紫荆子、兵豆,提取总DNA,基于ITS序列设计引物并进行PCR扩增,对扩增产物进行测序,用BioEdit分析软件进行序列比对,针对变异位点用Primer Premier 5.0设计特异性鉴别引物,进行PCR反应并考察反应条件.结果:ITS序列可以用于酸枣仁及其易混淆品种的鉴别研究,在位点特异性PCR反应条件考察中,DNA模板用量范围应为0.7 ～2.1 ng·μL-1,退火温度在59℃时特异性最佳,实验建立的方法对不同Taq酶和PCR仪具有普遍适应性.结论:研究设计的位点特异性引物在一定条件下的PCR反应中,酸枣仁能扩增出66 bp的条带,而其他混伪品不能扩增出条带,从而实现了酸枣仁与其混伪品的快速、准确鉴别. 【期刊名称】《中国现代中药》
【年(卷),期】2016(018)012
【总页数】5页(P1566-1570)
博雅汉语
【关键词】酸枣仁;ITS;特异性PCR;分子鉴定
【作 者】李桂林;宋雅迪;吕振晖;刘春晖;李佳;张夏楠
实践理性批判【作者单位】首都医科大学中医药学院,北京100069;首都医科大学中医药学院,北京100069;首都医科大学中医药学院,北京100069;首都医科大学中医药学院,北京100069;首都医科大学中医药学院,北京100069;首都医科大学中医药学院,北京100069
【正文语种】中 文
酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟种子。产自河北、陕西、辽宁、山东、河南、安徽等省。酸枣仁性平，味甘、酸，具有养心补肝、宁心安神、敛汗、生津的功能，用于虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴[1]。现代药理学研究表明，本品具有镇静催眠、镇痛抗惊厥、降压、降血脂、增强免疫功能、抗缺氧、抗心律失常、抗衰老、抗辐射及抗血小板聚集等作用[2]。由于酸枣仁野生资源减少，市场货源供不应求，药材市场上出现以同属植物滇刺枣Zizyphus mauritiana Lam.的种子理枣仁混作酸枣仁出售的情况，此外还有枳椇子Hovenia dulcis(又名拐枣仁)、
兵豆Lens culinaris、紫荆子Cercis chinensis等混伪品出现。目前对于酸枣仁的鉴别研究多采用药材性状[3]、显微特征[4]、薄层谱[5]、电泳[6-7]、紫外光谱[8-9]、扫描电镜[10]等传统鉴别方法，但由于该5个品种外观性状相近，显微组织特征不明显，化学成分复杂，以上这些方法专属性不强，且容易受到外加因素的干扰[11]。本实验即以ITS序列作为分子标记，应用位点特异性PCR技术筛选特异性鉴别引物，建立一种快速、稳定的分子鉴别方法以区分酸枣仁及其混伪品药材。
1.1 仪器
DYY-6D电泳系统(北京市六一仪器厂)，PCR仪(Life Technologies 公司，型号 Veriti；德国Eppendorf AG 22331 Hamburg；德国Eppendorf Mastercycler pro)，1-14台式离心机(德国SiGMR公司)，Vilber Lourmat凝胶成像仪(法国)，Plant Genomic DNA kit 50 Preps植物基因组DNA提取试剂盒(TianGen)。
1.2 试剂
2x Easy Taq®PCR SuperMix，2x Phusion High-Fidelity PCR MM W/HF Buffer，Trans F
astTaq DNA Polymerase(5U·μL-1)，TaKaRa dNTP Mixture 2.5 mm each，Trans 10x FastTaq Buffer(Mg2+)，Trans2K®DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)，琼脂糖Biowest® Regular Agarose G-10，Tiangen 10 000x GeneGreen Nucleic Acid Dye，10x Mops 电泳缓冲液[生工生物工程(上海)股份有限公司]。
1.3 药材
收集安国、亳州药材市场的20份材料，包括11份酸枣仁、5份理枣仁、2份枳椇子、1份紫荆子、1份兵豆，鉴定人为首都医科大学中医药学院李佳副教授。基尔霍夫定律教案
2.1 提取样品总DNA
取适量样品研磨成细粉，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取样品总DNA，于-20 ℃保存备用。
2.2 ITS片段扩增与测序
各样品采用ITS通用引物进行扩增[12]，ITS1：5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-
3′；ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反应体系总体积为50 μL，包括25 μL 2x Phusion High-Fidelity PCR MM W/HF Buffer，正反引物各2.5 μL，DNA 5 μL，无菌水15 μL。反应条件为98 ℃ 30 s，35个循环(98 ℃ 7 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s)，72 ℃ 7 min。产物由北京睿博兴科生物技术有限公司测序，各样品均采用正反双向测序，以保证结果的准确性。
2.3 构建系统发育树
根据测序结果利用CLUSTAL X软件进行序列排序，使用MEGA6进行遗传分析构建系统发育树。
2.4 设计位点特异性鉴别引物
根据2.2测序结果将酸枣仁、理枣仁、兵豆、枳椇子、紫荆子的ITS序列用CONTIG软件同源对齐并辅以人工校对，多重序列比对进行差异变异位点分析，根据变异位点采用Primer Premier 5.0软件设计特异性鉴别引物。引物序列由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。引物序列为ZmITS3F：5′-CAACCAGCGAACCCGTGAA-3′；ZmITS3R：5′-CCAAGGAAGGCTCCGTGACA3′。
复方红景天2.5 PCR扩增条件的确定
用设计的特异性鉴别引物进行PCR反应，反应体系为25 μL，包括12.5 μL 2x Easy Taq®PCR SuperMix缓冲液，正反引物各0.5 μL，DNA 35 ng·μL-1 共1.5 μL，无菌水10 μL。PCR反应条件为94 ℃ 5 min，35个循环(94 ℃ 30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 7 min。反应结束后取反应产物5 μL，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。为使PCR鉴别反应准确高效，考察了DNA模板量(0.4～2.6 ng·μL-1)、退火温度(53、55、56、57、59、61、63 ℃)、Taq酶种类(2x EasyTaq®PCR SuperMix、Trans FastTaq DNA Polymerase)以及不同PCR仪(Life Technologies 公司，型号 Veriti；德国Eppendorf AG 22331 Hamburg；德国Eppendorf Mastercycler pro)对PCR鉴别反应的影响。
3.1 酸枣仁及其混伪品的ITS分析及系统发育树的构建
采用Mega 6分析软件进行酸枣仁及其混伪品系统发育树的构建，采集NJ法构建系统发育树，见图1，采用Kimura2-parameter 距离，系统树各分支的置信度用bootstrap method检验，共进行1000次循环。从图1可知，酸枣仁与理枣仁的亲缘关系最近，其次为枳椇子，
与紫荆子和兵豆的关系较远，都可以区分开，可信度在98%以上，符合植物分类结果。证明ITS序列可以用于鉴别酸枣仁及其混伪品。
3.2 PCR反应条件考察
为建立准确、简便的酸枣仁及其混伪品分子鉴别方法，本文对设计的鉴别引物在PCR反应中的应用进行了全面考察。
3.2.1 DNA模板量的考察 对25 μL PCR 反应体系中的模板DNA用量进行了考察，分别设置为0.42、0.70、0.98、1.26、1.54、1.82、2.10、2.38、2.66 ng·μL-1，反应体系为：12.5 μL 2x Easy Taq®PCR SuperMix 缓冲液，正反向引物各0.5 μL，无菌水补齐。图2结果显示，模板浓度为0.42 ng·μL-1时正伪品均未出现条带，而提高到2.10 ng·μL-1及以上则全部出现条带，其余模板量均能区分开酸枣仁及其混伪品，因此确定本方法DNA模板浓度范围应为0.70～2.10 ng·μL-1。实验采用0.70 ng·μL-1 DNA模板浓度继续进行其他条件的考察。
3.2.2 退火温度的考察 设置退火温度分别为53、55、56、57、59、61、63 ℃进行考察，
结果见图3。退火温度为53、55、56、57 ℃时伪品依稀可见假阳性条带，退火温度提高至59 ℃时伪品无条带，而正品酸枣仁有清晰的特异性扩增条带，退火温度为61、63 ℃时，伪品无条带，而正品条带也不易扩增出来。因此，为保证PCR反应具有良好的可重复性及区分度，采用59 ℃作为此方法的退火温度。
3.2.3 两种DNA聚合酶的考察 除上述方法中使用的聚合酶2x EasyTaq®PCR SuperMix，本研究还考察了另一种常用聚合酶Trans FastTaq DNA Polymerase(5 U·μL-1)的反应效果。PCR反应体系为25 μL，其中Trans FastTaq DNA Polymerase(5 U·μL-1)0.2 μL，TaKaRa dNTP Mixture 2.5 mm each 2 μL，Trans 10x FastTaq Buffer(Mg2+)2.5 μL，正反引物各 1 μL，DNA模板 1.40 ng·μL-1(1 μL)，无菌水17.3 μL。PCR反应条件为94 ℃ 5 min，35个循环(94 ℃ 30 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 7 min，结果见图4。采用两种聚合酶的PCR反应条件下，伪品无条带，而正品均有66 bp特异性扩增条带，说明特异性引物可用多种酶进行实验，无单一局限性。
3.2.4 PCR仪对实验结果重复性的影响 选用3台不同PCR仪器及同一仪器多次实验，结果均能区分开酸枣仁及其混伪品。
模糊综合评价法
ITS序列是位于高等植物核糖体rRNA基因上高度重复的串联序列单位，被广泛用于被子植物系统学的研究，尤其是近源属间和属内系统学的研究。目前ITS序列作为植物分子鉴定的特异性片段在泽泻[13]、红景天[14]、肉苁蓉[15]等多种药用植物中得到探讨和应用，陈士林等[16]以ITS2序列为主体推出了植物类中药材DNA条形码鉴定的通用引物，并已得到了广泛应用。本实验即选用DNA条形码中的ITS序列作为分子标记，使用现有文献记录的ITS序列通用引物对收集的样品进行测序，构建系统发育树的结果也证实了ITS序列可以作为分子标记来区分酸枣仁及其混伪品，这与任莉等的研究结果相一致[17]。实验收集的样品是当前药材市场较为常见的混伪品，其中理枣仁与酸枣仁为同属来源，形态相近最不容易区分。本实验基于ITS序列设计筛选鉴别酸枣仁及其混伪品的位点特异性引物，建立了位点特异性PCR方法，并对其反应条件进行了一系列考察，力求得到稳定、可重复的鉴别体系，可以准确鉴别出酸枣仁及其混伪品。
位点特异性引物PCR具有操作简单、成本低、重复性好、鉴定条带单一、样品用量少等优点，此外可以极大降低PCR的假阳性率，保证鉴定结果的准确性[18]。本实验建立的分子鉴别方法，将为应用DNA条形码鉴别中药材提供理论依据，同时也为开发酸枣仁快速鉴别试剂盒打下理论基础。
【相关文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：366-367.
[2] 郑晔，钱苏瑜，游自立.酸枣仁药理作用研究进展[J].四川生理科学杂志，2006，28(1)：35-37.
[3] 孙柳源.酸枣仁的两种混伪品[J].浙江中医学院学报，2000，24(3)：73.
[4] 梅华，毕飞霞，张荣.酸枣仁、理枣仁、枳椇子三者之间性状、显微的区别[J].时珍国医国药，1996，(3)：51.
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