徐旭华1，黄国林2，胡莉娜1，牛静薇1，吴浪峰1，程晓欣1，刘月廉1*
（1广东海洋大学滨海农业学院，广东湛江
524088；2广东省湛江市绿海生物工程有限公司）
摘要：近年一种黑的霉菌对本地的桉树组培苗污染严重，对生产造成了较大的损害。通过对桉树组培苗污染霉菌的调查，取样
分离，获得2个单孢菌株。研究表明，菌株经r DNA-ITS 基因测序，在GenBank 数据库中进行同源性比对表明，与黑曲霉（A.niger ）相似性达100%。再构建系统发育树显示，2个菌株与黑曲霉（）多个菌株处于同一分枝上，而与其他近缘种有较远的遗传距离。综合分析，确定污染桉树组培苗的霉菌为黑曲霉（）。关键词：桉树组培苗；黑曲霉；形态学；ITS
1.2
污染菌培养基培养基为PDA ，其成分包括：马铃薯200.0g ，葡萄糖20.0g ，琼脂20.0g ，自来水1000mL 。121℃，0.11MPa ，20min 高压灭菌后冷却备用。1.3污染菌的分离
采用稀释涂布平板法对污染霉菌进行分离。用接种环取新鲜污染的组培苗试管中的霉菌表层孢子部分1环，加入分别盛有9mL 无菌水的6支试管中的第1支管，并按10-1~10-6的顺序进行稀释。在10-6管中取100μL 菌液，滴加到PDA 培养基平板表面，用涂布器将菌液均匀地涂布开来，然后放置于28℃恒温条件下培养2d 。将平板上长出的单菌落的菌丝尖端移入新鲜的PDA 平板上进行培养，因而获得纯单孢培养物。最后挑选2个具有典型曲霉形态特征的纯单孢培养物为代表菌株进行形态学和分子生物学研究。1.4污染菌的代表菌株形态学特征的研究
获得的纯培养物的代表菌株转接于PDA 平板上，28℃恒温条件下培养3d 。观察菌落的的生长速度、质地、颜等特征；光学显微镜下观察菌株的微观形态特征，主要包括菌落的分生孢子梗、足细胞、分子孢子头、分生孢梗茎、顶囊、梗基、瓶梗和分生孢子等的形状、大小、颜、表面纹饰等，同时还要观察产孢结构具体特征如产孢细胞的层数、长度和颜等，记录并拍照保存。
1.5污染菌代表菌株的分子鉴定
参照真菌基因组DNA 提取试剂盒方法，取培养3d 的菌丝体提取总DNA 。采用真菌ITS 通用引物序列ITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’
科学与人类行为
-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’[6-7]
网路管理，
按常规设置PCR 反应体系：94℃预变性4min ；94℃变性1min ，56℃退火1min ，72℃延伸1min ，32个循环；72℃保温10min ，4℃保存待用。PCR 产物经纯化、回收后，送广州华大测序中心进行序列测序。将获得的序列在NCBI 上进行Blast 比对，并选取同源性较高和形态相近菌株序列用MEGA7.0中的邻接法（neighbor-joining ）构建系统发育树，再用bootstrap 对系统发育树进行检验，1000次重
桉树（）是桃金娘科桉属植物的统称。桉树生长速度非常快，在我国南方热带、亚热带地区得到了广泛的推广种植。林业领域中，桉树由于产量高、质量好，成为了主要的造林育林品种[1]。随着我国成功地开发了高性能桉木重组材、桉木单板层积材，桉树的综合利用率已经提高至90%以上。桉树不仅仅为工业带来了价值，也给其他行业带来了经济效益。因此桉树的种植面积不断扩大，苗木的需求量也越来越大[2]。桉树组培苗具有保持母体优良性状、繁殖系数大、生长期短等优点，在种源缺少的条件下可快速满足市场需求。因此，组织培养是桉树优良品种快速繁殖的必要途径，对加速桉树人工林营建、提高其产量和质量有重要意义[3]。广东省湛江市的组培厂是主要的桉树组培苗生产基地，为全国提供了近一半的种苗，在桉树人工林产业发展中起到举足轻重的作用。但是，近年来该地的多个桉树苗组培厂在生产过程中普遍存在霉菌污染情况，据已有的调查报道，其在春夏秋季的污染率为20%~30%，冬季的污染率为10%~20%，给生产造成较大的经济损失[4]。据报道，污染率每升高5%，试管苗繁殖速度递减40%，室内直接生产成本递增10%，污染率越高，成本递增越大，当污染率达30%时，成本将增至106.5%[5]。本研究初步调查显示，近年一种黑的霉菌对广东省湛江市的组培
厂的桉树组培苗污染严重，并且广泛，对生产造成了较大的损害。为了弄清污染霉菌的种类，到适宜的控制措施，本研究对污染样品进行调查采样，并对污染菌进行分离和鉴定。结果报告如下：
1材料与方法
1.1样品来源
2019年5月21日，于广东省湛江市果蔬研究所组培厂调查桉树组培苗的污染率，并采集获得污染样本为污染菌分离鉴定备用。
基金项目：广东省科技攻关项目（2014A020208119）；广东海洋大学大学生创新创业训练计划项目（CXXL2019176）。第一作者简介：徐旭华（1996-），女，本科，研究方向：组织培养技术与应用。通信作者：刘月廉（1965-），女，博士，教授，研究方向：植物病理学
。
现代园艺2021年第9期
2
4〇
复[6-7]。
2结果与分析
2.1污染桉树组培苗的采样与调查
经过2年的跟踪调查，发现该污染在广东省湛江市果树蔬菜研究所组培厂桉树组培苗污染普遍，常年存在，其中在春、夏、秋季的污染率为40%~50%；冬季的污染率为10%~20%。桉树组培苗在外植体移入新的培养基时被污染，导致愈
伤组织不能正常形成；在
愈伤组织形成阶段污染时
导致植株个体不能形成；
组织培养车间的初代培养
阶段和继代培养阶段被污染，导致苗株黄萎、死亡（图1）。
2.2桉树组培苗污染霉菌的分离
通过单孢分离获得2个典型菌株，分别编号为MSA-1和MSA-2。2个菌株经初步形态学和ITS序列分析，完全一致，因此选择MSA-1菌株为代表进行培养特性及形态特征进一步的研究。
2.3桉树组培苗污染霉菌的形态学特性
代表菌株MSA-1接种于PDA培养基上，在28℃下培养3d。菌落表现为初期呈白，绒状，逐渐覆盖着一层浓密的黑粉状物。菌丝有隔。分生孢子梗不分枝，透明无，顶囊头状，近球形，表面呈辐射状长满单列小瓶梗。瓶梗着生分生孢子。分生孢子串生，球状，3.0~4.5μm，深褐至黑，表面粗糙。分生孢子梗长在足细胞上。足细胞壁厚，无，长50~100μm（图2）。该菌形态特征与黑曲霉（）[8]描述的一致，因此初步判断为黑曲霉（）。
3）。
2.5桉树组培苗污染霉菌的鉴定
研究结果表明，桉树组培苗污染霉菌的菌株MSA-1和MSA-2的形态特征与黑曲霉（）一致，ITS序列与黑曲霉（）同源性为100%，进一步构建系统发育树分析表明与黑曲霉遗传距离最近，综合分析鉴定，引起桉树组培苗污染的霉菌为黑曲霉（）。
3结论与讨论
通过对桉树组培苗污染霉菌的调查，发现其在春、夏和秋季的污染率为40%~50%；冬季的污染率为10% ~20%。经过取样分离，获得2个单孢菌株，分别为MSA-1和MSA-2。菌落初期呈白，绒状，逐渐覆盖着一层浓密的黑粉状物。菌丝有隔。分生孢子梗不分枝，透明无，顶囊头状，近球形，表面呈辐射状，长满单列小瓶梗。瓶梗着生分生孢子。分生孢子串生，球状，深褐至黑，表面粗糙。分生孢子梗长在足细胞上。足细胞壁厚，无。该菌形态特征与黑曲霉（）一致，初步判断为黑曲霉（）。进一步研究表明，菌株经r DNA-ITS基因测序，在GenBank数据库中进行同源性比对表明，与黑曲霉（）相似性达100%。再构建系统发育树显示，2个菌株与黑曲霉（）多个菌株处于同一分枝上，而与其他近缘种有较远的遗传距离。综合分析，确定污染桉树组培苗的霉菌为黑曲霉（）。有研究表明，植物组培污染物主要为细菌和真菌，其中细菌占52.13%，分布于9个种，主要为芽孢杆菌属和假单胞菌属；真菌占43.87%，分为18个种，芽枝霉（）、黑曲霉（）、青霉（.）和酵母为主要污染真菌。其中在组培生产车间空气中污染真菌多为毛霉（）、曲霉（）、青霉（）等，且以曲霉较常见[9]。这与本调查结果相近。（下转第30页）
图1桉树组培苗污染症
状
图2菌株MSA-1在PDA培养基上的形态特征
A：菌落；b：分生孢子梗彭大的顶囊及单列小梗；c：足细胞；d：成熟的
产孢体；e：分生孢子
2.4桉树组培苗污染霉菌的分子鉴定
为了从基因水平上进一步确定，菌株MSA-1和MSA-2经r DNA-ITS基因测序后，在GenBank上提交序列并分别获得登录号为MW188560和MW188561。在GenBank数据库中利用BlastN进行同源性比对表明，这2个菌株与黑曲霉（）（登录号为MH109325和MG675233）同源性为100%。进一步从GenBank数据库选择黑曲霉及其近缘种的r DNA-ITS 序列，与MSA-1和MSA-2菌株构建系统发育树。分析结果表明，2个菌株与黑曲霉（）的多个菌株处于同一分枝上；但与其他近缘种有较大遗传距离
（
图图3菌株MSA-1和MSA-2与近缘种建立的系统发育
树
2021年第9期现代园艺
25〇
（上接第27页）贡献排序为D 2＇＞B 3＇＞A 3＇＞C 3＇，雪梨红米保健饮料的最佳配方是雪梨汁18%、白砂糖
7%、蜂蜜4%、柠檬酸0.3%、红米提取液70%和综合添加剂。3
结语
雪梨压榨得到鲜果汁，控制酶解条件：混合酶添加量0.3%，pH 值3.5，酶解温度40℃，酶解时间1.5h 。
红米皮和胚芽按（1︰20）浸泡煮沸得到浸出液，最佳配方：鲜梨汁18%、蜂蜜7%、柠檬酸0.3%、红米煮出液70%、羧甲基纤维素CMC 0.1%~0.2%、安赛蜜0.05%、甜蜜素0.03%、苯甲酸钠0.02%~0.05%、乳化梨
香精0.02%、维生素C 0.01%，β-胡萝卜素0.01%。最后经过滤，杀菌，无菌装灌，成品。
雪梨和红米二者配伍，得到的产品营养丰富，酸甜爽口，滋味丰厚，清爽淡雅，泽优美。
（收稿：2020-11-12
）
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白银帝国 下载
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（上接第25页）黑曲霉生长在土壤、粮食、药材、虫体、枯枝落叶、动物粪便、腐败物及各种材料的基质上。主要以无性孢子的方式在空气中传播。全年皆可发现它们的踪影[10-11]。该菌适宜在碳源丰富的基质上生长，是微生物实验室的常见污染霉菌。也可在营养缺乏或缺少关键养分的环境中进行寡营养生长[12-13]。桉树组培苗生长环境适宜黑曲霉的生长和繁殖，也适宜其孢子传播。随着桉树组培苗的培育进程推进，越是后阶段的污染，其造成的损失就越大。因此，对该菌的防控做好环境卫生，减少提供该菌的生长基质，对空气采取定期消毒等措施。同时探讨有效的抑菌剂在培养基中的应用将是本研究未来的主要方向。
（收稿：2020-11-09
）
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异，说明半遮荫会显著抑制粉叶复叶槭的生长。
由图3和图4可知，黄金香柳、日本红枫、美国红叶紫薇、彩叶桂和粉叶复叶槭5种植物在3种不同土壤
中，植株的地径和株高年均增长量均无显著差异，说明B 1和B 2处理的土壤相对于红壤，对以上5种植物幼苗的生长无显著影响；金叶水杉、金丝柳和美国改良红枫3种植物，在B 1处理下植株的地径和株高年均增长量均低于B 2和红壤土处理，说明B 1处理会抑制这3种植物幼苗的生长；金叶复叶槭在B 1和红壤土处理下，植株的地径和株高年均增长量均显著高于B 2，说明B 2处理会抑制金叶复叶槭幼苗的生长；金叶国槐在B 1处理下植株的地径和株高年均增长量显著高于红壤土处理，说明B 1处理会促进金叶复叶槭幼苗的生长。
由图5和图6可知，黄金香柳、金叶水杉、金叶复叶槭、金叶国槐、金丝柳、美国改良红枫、美国红叶紫薇
和粉叶复叶槭8种植物植株的地径和株高年均增长量随施肥量的增加而增加，其中黄金香柳、金叶复叶槭和
金丝柳3种植物在C 1和C
2处理下植株年均增长量已无显著差异，说明当施肥量达到C 2水平时，再增加施肥量对3种植物的生长无显著促进作用；金叶水杉、金叶国槐、美国改良红枫和粉叶复叶槭4种植物在C 2和C 3处理下植株年均增长量无显著差异，说明当施肥量达到C 3水平时，再增加施肥量对3种植物的生长无显著促进作用；日本红枫、美国红叶紫薇和彩叶桂3种植物随着施肥量的植株年均增长量均无显著差异，说明施肥因素不是这3种植物生长的限制因素。
（收稿：2020-11-16）
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