赵雯玮1，王珊珊1，朱肖翔1，朱红波1，曹叶伟1，尹志娜2*
（1.西藏自治区食品药品检验研究院，西藏拉萨 850000；2.广东药科大学，广东广州 510006）疏血通
摘 要：牦牛生长于绿无污染的高原环境，具有独特的食用和营养价值。当前大量假冒伪劣产品充斥市场，欺骗消费者的同时也损害了牦牛肉的品牌价值，给西藏特产业造成巨大冲击。在此情况下，牦牛肉掺伪的检测方法应运而生。本文综述了牦牛肉掺伪PCR检测方法和研究现状，以期为今后牦牛肉掺伪检测技术的研发提供参考。 关键字：牦牛肉；掺伪；PCR检测
Current Status and Progress of PCR Detection Technology for
Yak Meat Adulteration托克维尔
ZHAO Wenwei1, WANG Shanshan1, ZHU Xiaoxiang1, ZHU Hongbo1, CAO Yewei1, YIN Zhina2*
(1.Tibet Food and Drug Inspection and Research Institute, Lhasa 850000, China; 2.Guangdong
Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)
Abstract: The yak grows in a green and pollution-free plateau environment and has unique edible and nutritional value. At present, a large number of counterfeit and inferior products flood the market, deceiving consumers but also damaging the brand value of yak meat, causing a huge impact on Tibetan characteristic industries. In this case, detection methods for adulteration of yak meat came into being. This article reviews the PCR detection methods and research status of yak meat adulteration, with a view to provide reference for the future research and development of yak meat adulteration detection technology.
Keywords: yak beef; adulteration; PCR detection
牦牛（Bos grunniens）因其能够适应寒冷、缺氧等极端恶劣的条件，长期以来一直是高原山区畜牧业的主要畜类资源之一[1-2]。我国的牦牛资源总量非常丰富，占全世界牦牛总数的95%以上，主要分布于甘肃青海、四川阿坝、西藏自治区等拥有高山地貌的地区[3-4]。牦牛肉蛋白质含量丰富[5-7]，必需氨基酸占氨基酸总量的35%以上，且大多数必需氨基酸的得分与联合国粮农组织和WHO推荐的氨基酸模式接近[8]，同时其生长于绿无污染的天然放牧环境，含有大量对人体有益的微量元素，具有极好的营养价值，故被誉为“牛肉之冠”，价格昂贵[9]。大量的投机者以甘肃集中舍饲牦牛或普通牛肉甚至
是其他肉源冒充牦牛肉或者牦牛制品获利，产生的后果是牦牛肉产品大街小巷到处可见，价格低廉，口感和营养与真实牦牛肉相差甚远。西藏牦牛肉形象骤降，直接或间接对西藏特产品对外输出产生的经济价值造成巨大影响。PCR（Polymerase Chain Reaction）技术即聚合酶链式反应，是利用DNA双链复制的原
基金项目：西藏自治区科技计划重点研发项目（XZ202001ZY0058G）；西藏自治区食品药品检验研究院科研项目（XZSYJY-YJKYXM-2020-02）；广东省医学科研基金项目（B2021312）；广东省教育厅创新强校项目（2018GkQNCX047）；广东省教育厅“创新强校工程”项目（2019GCZX012）。
作者简介：赵雯玮（1978—），女，河南安阳人，硕士，高级工程师。研究方向：食品安全检验与食品营养成分分析。
通信作者：尹志娜（1983—），女，天津人，博士，讲师。研究方向：食品安全检验与食品营养成分分析。E-mail:*******************
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Dec. 2021 CHINA FOOD SAFETY 181
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理，在生物体外大量扩增特定DNA片段的分子生物学技术。PCR技术现已广泛应用于各类动物食品的鉴定和检验，是未来快速高效的检测方法的重要研究基础和发展方向。
1 传统PCR法
最早TARTAGLIA等[10]利用PCR在饲料中进行牛源性成分的检测。此后又衍生了PCR-RFLP[11]（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）和PCR-SSCP（Single Strand Confor-mation Polymorphism，单链构象多态性分析）等技术。常规PCR具有快速、简便、特异性强的优点，是一种应用广泛的方法，原理是根据目的片段设计引物在DNA聚合酶和相应仪器作用下体外扩增部分或全部目的片段。缺点是对于检测技术人员的要求比较高，操作冗繁，需要娴熟的技术人员进行操作，不容易出结果。段庆梓等人[12]通过牦牛与其他常见物种Cytb基因的序列比对，设计牦牛特异性引物，并对PCR体系中不同条件、参数进行考察，最终建立了牦牛源性检测的PCR方法。通过牦牛与猪肉、水牛和黄牛不同比例混合肉样检测方法的研究，该体系对牦牛源性的检测低限可达到1%。同时，建立的牦牛特异性PCR鉴别体系对市售的牦牛肉制品有较好的方法适应性。杜倩男[13]等人用PCR-SSCP方法大规模检测九龙公牦牛β-酪蛋白基因型，实验结论为九龙牦牛公牛中CSN2基因的A1A1、A1A2和A2A2的基因型频率分别为6.9%，0.09.8%， 83.3%，A2A2型（n=85）占绝对优势；A1和A2等位基因频率分别为13.2%和86.8%，说明PCR-SSCP方法可靠，能大规模检测九龙牦牛β-CN的基因型。胡强[14]等人采用一对通用引物扩增细胞素b基因中一段长度为421 bp的 序列，并进行了克隆测序。结果显示，通用引物能很好地扩增不同动物细胞素b基因，扩增片段序列在牦牛与黄牛之间存在差异较大，能用于这两种肉的鉴定；而在金堂黑山羊、白玉黑山羊和美姑黑山羊之间差异非常小。以上研究建立了PCR-RFLP方法鉴定牦牛和黄牛肉，这对于动物保护以及来源不明的肉类产品的区分具有实际应用价值。细胞素b基因同源性比较显示：在所扩增的细胞素b 基因的保守区中，牦牛与黄牛间的序列差异为7.9%，与金堂黑山羊、白玉黑山羊和美姑黑山羊的序列差异在16.5%～17.2%，表明动物种属间序列差异较大；牦牛与犏牛的序列相同，犏牛为牦牛（母）与黄牛（公）杂交后代，表明线粒体DNA为严格的母系遗传；金堂黑山羊、白玉黑山羊和美姑黑山羊间的序列差异在0.2%～0.7%，表明山羊品种间的序列差异极小。实验结果表明，采用设计的通用引物便于进行动物种属鉴定，但是无法区分山羊的品种或牦牛的杂交后代。
2 实时荧光定量PCR法
实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。具有以下优点：经过特定比对后设计出的引物和探针可减小假阳性的发生概率；即使肉制品经过深度加工而导致其DNA发生一定程度的裂解，目标基因的扩增也不会受到影响，可进行快速批量检测，适用于样品量较大的肉源性检测工作[15]。定量实时PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）的产生，免去了PCR技术后续凝胶电泳的步骤，同时能对整个PCR反应过程进行实时监测，因此该方法目前已成为一种较普及的用于鉴别肉制品真伪
的方法[16]。苏葳艺[17]应用多重PCR方法鉴别牛肉中掺杂其他肉类，试验建立的复式PCR方法特异性强，操作简便，对于牛肉中掺杂鸡肉、猪肉、鼠肉的检出限均达到1%掺杂量。目前已有的关于肉源性成分鉴别的方法已经较多[18-19]，优点是能快速识别不同源性成分及其掺假比例。但目前部分方法仍存在灵敏度相对不高的情况，同时仪器成本较高，导致应用和覆盖度不高。
3 结语
传统的牦牛肉真伪检测主要进行感官评价、营养成分分析或者采用其他电化学及免疫化学法，但都不如PCR技术专一、高效和准确。传统PCR存在着操作复杂、耗时长、操作技术水平要求高以及不稳定因素多等缺点。而实时荧光定量PCR技术则具有快速、敏感、特异以及操作简单等优点，同时能够鉴别出是源性成分种类以及掺假比例等，是目前
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182食品安全导刊 2021年12月
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最先进和最稳定的检测方法。但实时荧光定量PCR 检测设备价格昂贵，在甘肃等大型养殖场尚且可以推广，而西藏地理结构特殊，主要采用自然放牧散养规模类型，因此并不适合推广和应用。课题组试
图探索到一些对西藏本土企业比较适用、成本价格以及技术要求相对比较低的方法。课题组已建立了等温扩增技术LAMP鉴别牦牛肉的方法，虽然目前正在克服假阳性的问题，但针对西藏地区的需求考虑，其优越性也是显而易见的。
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