2011No.8
44SerialNo.233ChinaBrewingR
esearchReport
16SrDNA克隆法分析小曲优势细菌
戴诗皎，翟平平，程颖源，王学峰，李睿
(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉430023)
摘要：用16SrDNA克隆法对某酒厂小曲中优势细菌进行分析，以期探讨强化酵母菌制曲后酒体风味变差的问题.用SDS.酶裂解法 提取小曲总DNA，采用细菌通用引物对用PCR方法扩增其16SrDNA，并对PCR产物进行克隆与测序分析.结果表明，小曲中的优势 细菌种类是以植物乳杆菌为主的乳酸菌.故强化制曲后发酵生产的白酒中乳酸乙酯含量增加，乙酸乙酯含 量下降，造成酒整体风味
变差.
关键词：小曲；优势细菌;16SrDNA克隆法；聚合酶链反应
中图分类号:TS261.1文献标识码:A文章编号:0254—5071(2011)08—0044—02 IdentificationofsuperiorbacteriainXiaoquby16SrDNAcloninglibraryanalysis DAIShijiao,ZHAIPingping,CHENGYingyuan,W ANGXuefeng,LIRui (CollegeofBiologicalandPharmaceuticalEngineering,WuhanPolytechnicUniversRy,W uhan430023,China)
Abstract:ToinvestigatethereasonswhyyeastadditiontoXiaoquresultsinliquorflavorloss,t hesuperiorbacteriainXiaoqufromadistillerywerei—dentifiedbysequenceanalysisof16SrDNAcloninglibrary.ThetotalgenomicDNAofXiaoq uwasextractedbySDS-proteaseKmethod.The16S rDNAfragmentswereamplifiedbyPCRwithuniversalprimers.Then,thePCRproductswer eclonedandsequenced.TheresultsshowedthattheSU.
periorbacteriainXiaoquweremainlylacticacidbacteria,representedessentiallybyLactoba cillusplantarum.Therefore,withtheadditionofyeastto
Xiaoqu,thecontentofethyllactateincreasedwhilethecontentofethylacetatedecreasedduri ngfermentation,whichcausedflavorlossofliquor.
Keywords:Xiaoqu;superiorbacteria;16SrDNAcloninglibraryanalysis;PCR
乳酸乙酯是白酒四大酯类之一.白酒香味成分之间
的关系复杂，白酒的香味物质是一个量的平衡.适量的乳
酸乙酯可增加酒的醇厚感，但如果生成的乳酸乙酯较多,
反而导致白酒发涩，口感较差[1].小曲白酒在湖北和湖南
等地的厂家均有生产.目前国内采用DGGE,RAPD,PCR.
克隆分析等分子生物学技术对大曲白酒微生物的研究比
较深入[2-51，小曲白酒的微生物区系的研究则相对滞后.某
小曲白酒生产厂家在采用强化酵母菌制曲工艺后，出酒
率虽然提高，但发酵生产的白酒中乳酸乙酯含量增加，乙
酸乙酯含量下降，造成酒整体风味变差.本研究采用16S
竹节三七rDNA克隆法对该厂使用的小曲优势细菌进行分析，以期魏书生
为上述问题寻到答案.
1材料与方法
1.1试剂
DNAma~er,PCR产物纯化试剂盒：日本Takara公司;河洛大鼓书
pGEM.TEasy~体系统：美[]Promega公司；质粒快速提取
试剂盒：美国Omega公司;Taqmix预混合PCR试剂盒：武汉
华顺生物技术有限公司;GoldView核酸染料：上海赛百盛
基因技术有限公司.引物委托武汉鼎国生物技术公司合成.
1.2仪器与设备
SW.CJ.mV超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司;
TGRAD~NTPCR/t~：德国WhatmanBiometra公司;GBOX.
H12.E.M自动凝胶成像分析系统：英[]Syngene公司;DYY.
2C电泳仪：北京六一仪器厂；台式高速冷冻离心机：德国
Eppendorf公司.
1-3方法
1.3.1SDS.酶裂解法提取DNA
按照参考文献[6]进行.
1.3.216SrDNAPCR扩增
本实验采用文献报道的细菌通用引物对r刀一上游引物
为:5.AGAGTTTGATCCTGGCTCAG一3下游引物为:5一AAGGAGGTGATCCAGCC一3预期PCR产物大小为
1600bp左右.
PCR体系:10xbuffer5.0~L,dNTP4.OIxL，上下游引物
各1.01xL，模板1.01xL,ExTaqDNA聚合酶0.51xL，补ddH20至
501~L.
PCR反应条件:94℃预变性5min;94oC,45s,55oC,45s,
北京击剑俱乐部
72℃,1.5min，循环扩增30次;72oC,10min.取5LPCR产物
用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析.
1.3.3PCR产物克隆与测序分析
PcR产物用Pc物纯化试剂盒纯化后，连接到pGEM.T
Easy载体系统上进行TA克隆，用含X.Gal/IPTG和氨苄青
霉素的LB琼脂平板进行蓝白斑筛选阳性重组子.阳性菌
于含氨苄青霉素的LB培养基中37~C过夜培养后抽提质
粒，经EcoRI酶切验证，用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析.将验
证确认的重组质粒，送生工生物工程(上海)有限公司武汉
收稿日期:2011-04—08
基金项目：湖北省自然科学基金重点项目(2009CDA118)
作者简介：戴诗皎(1988一)，女(壮族)，广西南宁人，在读硕士研究生，研究方向为食品安全；李睿?，副教授，通讯作者.
研究报告中国酿造2011年第8期
总第233期?45?
测序部双向测序.
用DNAstar软件将测序得到的16SrDNA基因序列进
行拼接，得到完整的16SrDNA序列，提交~ONCmGenBank 数据库(bi.v)进行序列比对.选择
与待检菌株同源性最高的典型菌株，用mega4.1软件采用邻位相连法(Neighbor-joining)构建16SrDNA进化树.根
pdl据基本的进化树拓扑结构，采用1000次Bootstrap抽样对树进行评价分析.
l-3.4醋酸菌16SrDNAPCR扩增
从NCBIGenBank数据库下载醋酸菌16SrDNA序列,
用ClustalX2进行序列比对，根据其保守区设计醋酸菌16S rDNA特异性引物.上游引物为:5'.CGCTGTAAACGAT GTGTGC.3'下游引物为:5'一AAGGTCAAACCAACTCC—CA T.3'预期PCI物大小为627bp.
PCR体系为:12.51xLTaqmix,101xmol/L上下游引物各
0.5txL,lLDNA模板，补枷20至25txL.PCR反应条件:
94℃预变性5min;94℃,60s,55oC,30s,72℃,45s，循环扩
增30次;72℃,lOmin.取5txLPCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析.
逐步回归分析2结果与分析
2.116SrDNAPCR扩增与克隆测序
用SDS一酶法提取的小曲总DNA大于15kb，获得的DNA 非常完整.将该法获得的DNA进行16SrDNAPCR扩增,
结果见图l.将PCR产物纯化后，进行TA克隆，随机选取11 个克隆送生物公司进行双向测序.将测序结果在NCBI GenBank数据库进行同源性比较分析.将11个克隆与其
同源序列进行系统发育分析，结果见图2.
2000bp
1000bp
500bp
100bp
2
M:DL2000DNA分子量标准;1：小曲DNAPCR扩增产物;2：阴性对照图116SrDNAPCR产物电泳图
Figure1.ElectrophoresisofPCR-amplified16SrDNA
图2中菌株NCBI序列号:AY675256为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，菌株NCBI序列号:CP000416
为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，菌株NCBI序列号:EF
059987为乳酸片球菌(Pediococcusacj删ac如j).可以看
出，克隆B属于短乳杆菌，克隆B.,BB.,B,BB,B.,
BB.等都属于植物乳杆菌，克隆B为乳酸片球菌.
U5
图216SrDNA进化树
Figure2.Phylogenetictreeof16SrDNA
2.2醋酸茵16SrDNAPCR扩增
取纯种醋酸菌DNA，作为阳性对照，验证提取的小曲
总DNA是否包含醋酸菌DNA；无菌双蒸水作为阴性对照.
将小衄DNA，醋酸菌DNA和无菌双蒸水同时扩增，结果
见图3.
750bp
500bp
250bp
100bp
1000bp
500bp
250bp
N：阴性对照;M1:DL2000分子量标准;1：小曲DNAPCR扩增产物2：阳性对照;M2:DL10000分子量标准
图316SrDNAPCR产物电泳图
Figure3.ElectrophoresisofPCR-amplified16SrDNA
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