茎-环RT-PCR法定量miRNA-421的引物设计 赵丽;杨洋;温传俊
【摘 要】本研究旨在通过茎环RT-PCR法,建立有效定量miRNA-421的PCR方法,探讨该方法在定量检测miRNA方面的应用价值.利用miRBase数据库获得miRNA-421的成熟序列.设计3条miRNA-421特异性反转录引物,Q-PCR上游引物及通用下游引物.通过10倍梯度稀释RNA后特异性反转录,RT-PCR分析不同引物互相配对PCR的扩增曲线及熔融曲线,鉴定出特异性好、扩增效率高的引物.为进一步鉴定引物的有效性,过表达miRNA-421,用鉴定的成熟引物定量扩增.利用茎-环RT-PCR法设计、鉴定出miRNA-421引物:421RT7、F19,且这对引物特异性好、扩增效率高.通过设计引物组合,茎-环RT-PCR法能够很好地用于miRNA定量分析,并具有准确、快速、节约成本的优点.%This study was to establish a method of quantitative detecting miRNA-421 by stem-loop RT-PCR, and to evaluate the feasibility of this method in quantitative assay miRNA. miRBase database was used to get the mature sequence of miRNA-421. 6 primers were designed, including 3 primers for miRNA-421 specific reverse transcription, 2 forward and 1 general reverse primers for quantitative PCR, respectively. Di fferent RT primers and forward primers were paired in Q-PCR. RNA after 10 times dilution was reverse transcribed and then detected by Q-PCR. Amplification curves and melting curves were analyzed to identify the primers with high specificity and efficiency of amplification. In order to further validate this primer, miRNA^21 was over-expressed in HepG2 and detected by Q-PCR. 2 primers, 421RT7 and 421F19 with high specificity and efficiency of amplification were obtained using stem-loop RT-PCR. Stem-loop RT-PCR provided a method that enabled fast, accurate and sensitive detection of miRNA.
【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2012(035)002
【总页数】6页(P83-88)
【关键词】茎-环RT-PCR;miRNA-421;引物设计
【作 者】赵丽;杨洋;温传俊
曹仁伟
【作者单位】南京师范大学生命科学学院分子细胞生物学研究所,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院分子细胞生物学研究所,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院分子细胞生物学研究所,江苏南京210046 【正文语种】中 文
【中图分类】Q28
Micro RNA(miRNA)是一类在真核细胞中广泛存在的非编码单链小分子RNA，其长度为19 nt～24 nt［1］．miRNAs通过与靶基因mRNA的3'非翻译区互补结合，抑制靶基因的翻译或诱导靶基因的降解和基因沉默［2，3］．人类基因组编码超过 1 000 个 miRNA［4］，据推测，人类超过 30%的基因受 miRNA 的调控［5］．
由于miRNA成熟序列只有19 nt～24 nt，没有poly(A)，家族成员成熟序列差异小，在细胞中的表达水平普遍较低等，对miRNA的定量检测就存在一定的难度．目前，定量检测miRNA的方法有:Northern杂交法［6］、微阵列法［7］、克隆和测序法［8］、实时荧光定量 PCR 法［9，10］等．miRNA 茎 － 环状引物反转录检测法(stem-loop RT-QPCR)［11］是实时荧光定量PCR法中应用较为广泛的一种．
上海集邮网
由于miRNA成熟序列短，茎环法通过人为地延长miRNA的长度以利于片段的扩增．特异性反转录引物由一段较长的共有序列和一段与miRNA成熟序列特异性互补的序列构成，经过退火反转录后，miRNA被人为延长反转录为较长的cDNA．设计的Q-PCR扩增正向引物3'端与miRNA反向互补，下游引物与反转录引物共有序列中通用引物的结合位点反向互补．该方法具有灵敏度高，样品消耗量少，检测范围广，定量线性范围宽的优点．
目前对miRNA的研究中，定量试剂盒和TaqMan探针法是研究者大多采用的miRNA定量方法，对miRNA-421的定量研究也是如此［12-14］．这些方法虽然特异性好、灵敏度高、样品消耗量少，但是与茎－环RT-PCR法定量miRNA-421相比，价格昂贵、步骤繁琐，而且可以定量检测的样本量有限．本实验通过茎－环RT-PCR法，建立有效定量miRNA-421的PCR方法．该方法的建立为今后利用SYBR GreenⅠ染料，茎－环法定量检测样本中的miRNA奠定了基础．
人乳腺癌MCF-7细胞、人肝癌细胞HepG2来源于本实验室，RPMI1640培养液、DMEM高糖培养基及胎牛血清购自GIBCO，总RNA抽提试剂Trizol及转染试剂Lipo2000购自Invitrogen，RT-PCR试剂盒、SYBR Premix EX Taq(Perfect real time)试剂均为TAKARA公司产品，miRNA-421及其阴性对照购自上海吉玛公司．
刘真露点
人乳腺癌MCF-7、人肝癌细胞HepG2置于另加RPMI1640培养液和10%胎牛血清的培养基中，于37℃、5%的CO2培养箱中培养．1.3 方法
1.3.1 MicroRNA-421成熟序列的获得
在miRBase数据库(www．mirbase．org)中获得hsa-miR-421成熟序列(MIMAT0003339):5'-AUCAACAGACAUUAAUUGGGCGC-3'．
1.3.2 miRNA-421引物序列的设计
对于每1个miRNA，设计了3条引物:1条特异性反向引物用于反转录，1条正向引物，还有1条通用的反向引物．
每个特异性反转录引物的都带有1段固定的序列，可以形成1个茎环，其5'端的36个核苷酸序列是固定的，固定的序列为:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3'，其形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3'端的6～8个核苷酸就与miRNA反向互补，分别命名为421RT6、421RT7、421RT8(引物序列见表1)．
正向引物长约25～32个核苷酸，在3'端有11～18个核苷酸与相应的miRNA互补．每个正向引物也带有1段固定的序列，固定的序列为:ACACTCCAGCTGGG．在这个序列后加上miRNA成熟序列，5'端起除3'端6～8个核苷酸后剩下的碱基序列，把U变成T即可．因为我们设计的正向引物分别包含mir-421成熟序列5'端18、19个核苷酸，因此命名为421F18、421F19．
通用的下游引物(General Reverse，GR)23 nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构部分．通用下游引物序列见表1．
U6基因作为内参，其特异性反转录引物与反向引物序列相同，见表1．
1.3.3 总RNA提取及质量检测
收集MCF-7细胞，根据Invitrogen公司的使用说明，采用Trizol法提取细胞总RNA，所得RNA溶于0.1%DEPC水中．总RNA样品经过2%琼脂糖电泳检测RNA完整性，再用Nanodrop光度计测定RNA的浓度，读取在260 nm和280 nm波长处的光吸收值的比值．
水泵扬程1.3.4 RNA特异性反转录
在做逆转录时用的引物不再是oligodt和random6，而是改用miRNA对应的特异性反向引物(加上一个U6特异性反转录引物)．
取MCF-7细胞RNA(无需去除基因组)，参照PrimeScript RT reagent Kit试剂盒说明操作合成cDNA，以miRNA-421特异性反转录引物mi421RT6为例，20 μL反转录体系如下:5×primer script buffer 4 μL，Enzymix 反转录酶 1 μL，mi421RT6 0.5 μL，U6 特异性反转录引物(U6R)0.5 μL，RNA 1 ug，加水(无 RNA酶)补至20 μL体系;同时用RNase-free水10倍梯度稀释RNA，使20 μL反转录体系分别含有RNA 0.1 ug、0.01 ug、0.001 ug、0 ug(RNase-free水)，即以mi421RT6为引物特异性反转录5个体系，使其各体系中分别反转录 RNA 1 ug、0.1 ug、0.01 ug、0.001 ug、0 ug．其他 2 个 mirRNA-421 特异性反转录引物 mi421RT7、mi421RT8同上进行反转录．反应条件为:42℃温育15 min，85℃ 5 s灭活逆转录酶，4℃保存．
液压集成块设计1.3.5 定量PCR反应鉴定引物
由于miRNA成熟序列短，碱基数目及序列固定，可能会产生引物二聚体、发夹结构等引物二级结构从而影响扩增．因此在设计的几组miRNA特异性引物需要经过鉴定，筛选出特异
性好、扩增效率高的引物才能够使用．
搅拌机设计以 U6为内参，实时荧光定量PCR，20 μL反应体系:2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，模板cDNA 1 μL，上下游引物(10 μM)各 0.5 μL，双蒸水定容至 20 μL．实时荧光定量检测时，上游引物 421F18、421F19分别与通用下游引物PCR扩增3组模板cDNA:421RT6、421RT7、421RT8(各有5个浓度梯度)．
反应条件为:95℃变性1 min，95℃ 30 s，65℃ 1 min，40个循环，循环结束后从55℃开始每10 s上升0.5℃，取荧光值绘制溶解曲线，确定扩增产物的特异性，用2－ΔΔCt法分析数据结果．1.3.6 转染miRNA-421并Q-PCR检测
将HepG2细胞接种到6孔板，当24 h后细胞汇合度为40% ～50%时进行转染，设置MOCK、NC、miRNA-421(NC、miRNA-421终浓度均为50 nM)3组，转染48 h后收集细胞，采用Trizol一步法提取细胞总RNA．总RNA提取、反转录方法同上，实时荧光定量PCR检测miRNA-421的表达．
提取的总RNA经2%琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计测定OD260/OD280的比值，将没有降解、OD260/OD280的比值为1.8～2.1之间的RNA样品进行反转录．
RNA经10倍梯度稀释后反转录、Q-PCR检测，产生的循环阈值Ct在理论上相差约3.3倍．由于实验过程中影响因素较多，实验数据没有理论值标准，但是从表2中可以看出内参U6的Ct值之间的差值(模板cDNA含量相差10倍)大约为3.3，而miRNA-421经反转录引物421RT7特异性反转录、421F19及通用下游引物配对扩增之后的Ct值的前3组差值也接近于3，并且通过熔解曲线图(图1)可以看出引物具有较好的特异性．因此我们认为miRNA-421的Q-PCR扩增引物能够在实时荧光定量PCR中真实有效地反映模板中miRNA-421的含量．
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