2.请提供50ml PCR扩增产物(总量1ug-2ug)； 3.取3ml样品，应该能够清晰的分辨出目的条带；自带引物，引物浓度 为5-10uM，并请注明。
1995年语文高考第一题
备注
纯化后PCR产物的要求1.PCR产物溶于蒸馏水中(请勿溶解在TE溶液中)；顺铂的不良反应
2.浓度大于20ng/ml，体积大于10ml，长片段需适当增加量；
3.电泳检测条带专一；自带引物。
所有
模板均应提
供相应的引
物信息
自带质粒的要求1.质粒溶于30~50ml ddH2O中(请勿溶解在TE溶液中)，电泳检测浓度大50~100ng/ml；
2. 建议用相关试剂盒提取质粒；
3. 如有可能，同时提供1ml含有相应质粒的菌液备用；
乙醇偶合制备C4烯烃4. 需注明载体和插入目的片段长度、以及测序要求。
菌液模板的要求1.说明载体抗性类型，我们提供A mp, Kan, Tet及Chl四种抗生素；
2. 其余类型抗生素需自备；应为高拷贝质粒，对于低拷贝质粒，请直接提供约1mg纯化质粒；
3. 提供1ml左右过夜培养（12h）的菌液，加15%灭菌甘油，于E ppendorf 管中封口保存，防止交叉污染或渗漏；
4. 大量样品测序，建议在一次性塑料培养皿固体培养基上穿刺培养；
5. 建议尽量提供穿刺培养或斜面培养的菌种（装在EP管中）。
自带引物的要求1.浓度不低于5pmol/ml(或5umol/L)，溶液体积15-50ml；
王连笑2. 随机引物（RA PD引物）和简并引物以及引物长度不足15bp不能用于
本公司提供如下通用测序引物：M13+，M13-，T7, SP6, T7 ter，BGH rev, pGL3+, pGL3-，pGEX5’，pGEX3’，5’AOX1，3’A OX1 ，a-factor。其他引物请自带或提供序列由我们合成。
数字信号处理系统常用载体特征
PCR类型测序模板注意事项
∙总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。
3ul样品总量不低于50ng(非常小的PCR产物可以酌情减小)，PCR产物产量过低说明PCR扩增结果不是很理想，应改进条件重新扩增。
∙对于有杂带和扩增弥散的PCR产物，需经琼脂糖电泳将目的片段切下来并回收，建议将PCR产物作克隆后进行测序。有杂带的和扩增弥散的PCR产物即使通过琼脂糖电泳纯化，测序仍有可能出现双峰等异常结果。
∙经上述检测合格的PCR产物，需经过琼脂糖电泳纯化去除未反应的引物，dNTP，引物二聚体等影响测序反应的组分。有多种纯化方法可供选择，P romega，Qiagen和生工等公司都有相应的产品可供选择。纯化后的PCR产物经电泳检测估计总量应不低于200ng/Kb(非常小的PCR产物可以酌情减小)。∙与质粒模板相比，PCR产物彼此间差异很大，因此，每个PCR模板应尽可能提供相应的PCR退火温
度和PCR产物的长度，以供测序时参考。
∙PCR模板一般不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后进行测序。
∙纯化好的PCR产物应溶于双蒸水中，TE缓冲液会严重影响测序反应。
∙若让公司对PCR产物进行纯化，PCR产物需满足∶总量不低于1ug/kb，片段长度不低于200bp
∙各种PCR测序模板均应提供相应的测序引物，并尽可能提供引物的全序列，并将引物浓度准确稀释到5pmole/ul 。
引物浓度的换算关系∶
总ng数= pmole x 分子量/1000
由于PCR产物测序相对较难，为使您能拿到一个好的结果，请尽量满足上述要求。会计 审计
DNA测序常见问题分析及解决办法总结
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