miRNA常用实验方法

一、miRNA的检测方法

miRNA的realtime-PCR检测方法

1、realtime-PCR引物设计

miRNA realtime-PCR引物设计方法：

1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。通用茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC

例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT

辽宁警网2）realtime 上游引物设计：miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

3）下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。

4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要3%以上的琼脂糖胶）。

2、miRNA反转录

miRNA的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。因为其产物很短，用最普通的逆转录酶即可。我们一般使用的是TIANGEN的MLV，逆转录体系为：

RNA 500ng~2ug

5xbuffer 2ul

dNTP 0.25ul

DDT 0.25ul

RRI 0.25ul

MLV 0.25ul

RT primer 0.5ul

H2O(RNase free) 补至10ul

程序为（PCR仪中通常命名为CTFRT）16度，30min；42度，60min；85度，5min；4度，hold。

！！做miRNA的反转录时，注意不要忘记内参的RT，即一个样品至少要做目的miRNA和内参两管反转录反应。

3、realtime-PCR实验

miRNA逆转录完成后得到的cDNA即可进行下一步PCR。在确认引物的特异性后，我们可以进行正式实验。一般每个样品至少需要3个平行孔。Realtime PCR体系为（ABI定量PCR仪需要加ROX dye II， Biorad 定量PCR仪不需要加ROX）：

2X SYBR 10 ul

ROX II 0.4ul （Biorad 不加）

Primer 1ul

Template 1ul

H2O 7.6ul （Biorad 8ul）

需要注意的几点：1）在配制PCR体系时，请一定配制总体系，逐步分装。每步分装前充分混匀。这一点是PCR平行性的保证。2）配制体系尽量在冰上进行。3）请选用比较准确的进行体系配制，并注意体系的冗余。一般来说，配制一整个96孔板的PCR体系，我会配制100个反应的总量，保证分装到最后稍有剩余。

软件安全

PCR 程序：95度，1min；95度，5s；60度，34s（此步在读取荧光值）。40到45个循环。

4、realtime PCR结果分析

realtime PCR反应结束后返回Ct值，可以利用定量PCR仪软件自带的程序进行分析，也可以利用EXCEL表格进行相对定量计算。具体的计算方法：将三个平行孔的数值拷入到EXCEL表格的相应位置，即可自动计算出相对值。注意，第一组样品的值将被默认为归一为1。其他的样品与之相比得出相对值。EXCEL表格公式见附件。

二、miRNA靶基因的预测

miRNA靶基因预测软件简介

1、TargetScan：/

尾矿库

首先选择预测的物种，如果要预测小鼠的miRNA和靶基因，则点击右上角的“Go to TargetScanMouse”。第二个选项可输入基因名（有时不识别别名），点击submit即可，此操作可预测可能靶向该靶基因的miRNA；或者输入miRNA的名字，点击submit，此操作可以预测该miRNA的靶基因。

冯诺伊曼2、Pictar：u.edu/

输入网址后进入pictar主页，下面有几个可选用的数据库，一般选用最后两个数据库即可。点击进入预测界面。选择物种，选择要预测的miRNA(注意：如果你感兴趣的miRNA在下拉菜单中未列出，则不可预测，可考虑换用其他软件)并点击search for targets of a miRNA或输入gene ID（注意：与targetscan不同，pictar一般不识别基因名，最好输入gene号：N

M_*****）点击search for all miRNAs predicted to target a gene.进行预测。

3、Mirbase：www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/search.pl

分别输入miRNA名或基因名即可进行预测。其他选项不用更改。

夏普sh8298u

爪形手

预测结果的处理和分析

我们通常会将三种不同软件的分析结果做比较，选取两种以上软件预测的交集部分作为我们候选的靶基因。如果这样的结果仍然过多，可以选取三种软件预测的交集进行下一步筛选。如果三种软件预测的结果没有交集部分，可以取并集，然后从中按功能提示进行挑选。

三、miRNA的过表达和敲低

1、过表达

过表达miRNA一般可采用两种方法：a 构建过表达载体；b 人工合成成熟miRNA。

本文发布于:2024-09-24 08:28:57，感谢您对本站的认可！

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