RT-PCR
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。一、反转录酶的选择1. Money 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有强的聚合酶活性,RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。3.Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶:在Mn2+存在下,允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构。4.MMLV反转录酶的RNase H-突变体:商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其 它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
二、合成cDNA职来职往第66期刘璐引物的选择
1. 随机六聚体引物:当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2. Oligo(dT):是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞结合律mRNA具有3’端Poly(A+)尾,此引物与其配对,仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%,故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物:最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物,若PCR反应用二种特异性引物,第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的PCR扩增。
楚雄师范学院学报二、 试剂准备
1.RMA金属表面处理技术提取试剂
2.第一链cDNA合成试剂盒
3.dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
4.Taq DNA聚合酶
三、操作步骤
1. 总RNA的提取:见相关内容。
2. cDNA第一链的合成:目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
(1)在0.5ml微量离心管中,加入总RNA 1-5μg,补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl,轻轻混匀、离心。
(2)70℃加热10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物:
10×PCR buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTPmix 1μl
0.1M DTT 2μl
轻轻混匀,离心。42℃孵育2-5min。
(3)加入SuperscriptⅡ1μl ,在42℃水浴中孵育50min。
(4)于70℃加热15min以终止反应。
(5)将管插入冰中,加入RNase H 1μl ,37℃孵育20min,降解残留的RNA。-20℃保存备用。
3.PCR:
(1)取0.5ml PCR管,依次加入下列试剂:
第一链cDNA 2μl
上游引物(10pM) 2μl
下游引物(10pM) 2μl
dNTP(2mM) 4μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶(2u/μl) 1μl
(2) 加入适量的ddH2O,使总体积达50μl。轻轻混匀,离心。
(3) 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在PCR扩增目的基因时,加入一对内参(如G3PD)的特异性引物,同时扩增内参DNA,作为对照。
(4) 电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。
(5) 密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。
四、注意事项
1. 在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂。
2. 为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照。
3. 内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4. PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定。
5. 防止DNA的污染:
(1) 采用DNA酶处理RNA样品。
(2) 在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。
百合鳞片总RNA提取方法的比较
杜运鹏 李双 何恒斌 杨爽 贾桂霞
【摘要】:为了筛选出适合百合鳞片的总RNA的提取方法,本研究以东方百合品种Siberia的鳞片为材料,比较了Trizol法、改良Trizol法、RNA提取试剂盒以及改良CTAB法提取RNA的效果。结果表明:Trizol法、改良Trizol法及RNA plant plus Reagent提取试剂盒均不能提取到完整的RNA;离心柱型植物总RNA提取试剂盒存在DNA污染;改良CTAB法能有效去除多糖,28S条带的荧光亮度是18S条带的1.5~2倍,D260/D280值都在1.9~2.1之间,D260/D230值大于2,两个样品的平均得率分别为103.57μg/g和119.21μg/g,说明此方法适合百合鳞片RNA的提取。RT-PCR结果扩增出了特异性条带,说明改良CTAB法从百合鳞片中提取的RNA质量高、完整性好、产率高,完全可以用于后续的分子生物学实验。
灰绿藜RNA提取方法及在cDNA文库构建中的应用
摘 要:
目的:为分离灰绿藜耐盐相关新基因,构建叶片cDNA文库,探索从盐生植物中提取高质量RNA的方法。方法:以灰绿藜叶片为材料,应用RNA Plant Reagent法(Tiangen)、Plant RNA purification Reagent法(Invitrogen)、UNIQ柱式总RNA试剂盒提取法(Sangon)、SDS-LiCl法、TRIZOL试剂法(Invitrogen)等进行总RNA的提取,并构建其全长cDNA文库和抑制消减文库。结果:RNA Plant Reagent法、Plant RNA purification Reagent法和UNIQ柱式总RNA试剂盒提取法获得的RNA完整性均不好;SDS-LiCl法提取的RNA完整性好(28S条带亮度是18S的2倍、条带锐利清晰)、纯度高(A250/A260为1.89±0.03,A260/A230为2.23±0.02),适合用于直接反转录及构建全长cDNA文库,并获得成功;TRIZOL试剂法简单快捷,产率高(2724±82μg/g),完整性较好,可经mRNA纯化后用于抑制消减文库的构建并获得成功。结论:建立了用于构建高质量cDNA文库的灰绿藜RNA的制备方法。
CDNA
构建
分为六个阶段:
阶段1:反转录酶催化合成cDNA第一链
阶段2:cDNA第二链的合成
阶段3:cDNA的甲基化
阶段4:接头或衔接子的连接
阶段5:Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA
阶段6:cDNA与λ噬菌体臂的连接
详解
一).构建cDNA文库:
以生物细胞的总 mRNA 为模板,用逆转录酶合成互补的双链 cDNA ,然后接到载体上,转入到宿主后建立的基因文库就是 cDNA 文库。
1、mRNA的提取及其完整性的确定
1) 总 RNA 的提取
RNA 提取方法:APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA
2)mRNA 的分离
高等真核生物 mRNA 分子的 3' 端均有 poly(A) 尾,将总RNA通过寡聚(DT)纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA。在某些情况下,裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径。
3) mRNA 的纯化 ①按照大小对总 mRNA 进行分级,主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级;②多聚核糖体的免疫学纯化法,这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。
4)mRNA 完整性的确定
确定 mRNA 完整性的方法有三种:
① 直接检测 mRNA 分子的大小;
② 测定 mRNA 的转译能力;
③ 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。
2、 cDNA 的合成和克隆
1) cDNA 第一链的合成
用亲和层析法得到 mRNA 后,根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理,用 12~20 个核苷酸长的 oligo ( dT )与纯化的 mRNA 混合, oligo ( dT )会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物,反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo ( dT )结合在 mRNA 的 3' 端,因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端,有时这种全合成难以达到,尤其是 mRNA 链很长时,为此建立了一种随机引物法合
成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸,由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo ( dT )仅与 mRNA 3' 端结合不同,它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前,必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链,即形成双链 DNA 分子。
2). 双链 cDNA 的合成
合成 cDNA 第二条链有两种方法。一种方法是利用 cDNA 第一链的 3' 末端常常出现发夹环的特征,这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果,它为合成 cDNA 第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环,可以用单链特异的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的处理,常常会“修剪 ” 过多的 cDNA 顺序,使 cDNA 丢失了 mRNA 5' 端的部分顺序。 另一种方法是用大肠杆菌的 RNase H 进行修饰。 RNase H 能识别 RNA-DNA 杂交分子并把其中的 RNA 切割成短的片段,这些 RNA 短片段仍与 cDNA 第一链结合,可被新合成的 DNA 所取代。新合成的 DNA 存在切口,用 DNA 连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的 DNA 链。 RNase H 法优于 S1 核酸酶法,它能获得包括 mRNA 5' 端全部或绝大部分的更长顺序 cDNA 分子。
3) 将 cDNA 重组到载体上 合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法:
① 借助于末端转移酶的 3' -OH 端合成均聚物的能力,双链 cDNA 和线性化载体 DNA 的 3' -OH 端分别加上均聚核苷酸链;
② 双链 cDNA 和线性化载体 DNA 分别用 Klenow 片段进行末端补平,然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接,形成重组体;
③ 通过粘性末端连接。
4). 转化
孢子 重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株。当不同重组的 DNA 含有不同的 cDNA 基因时,整个转化子含有来自 mRNA 体的各种 cDNA 基因,这样的转 化子体构成该 mRNA 全部遗传信息的 cDNA 基因文库。
5). 目的 cDNA 克隆的鉴定
用于从 cDNA 文库中筛选和鉴定目的 cDNA 的方法主要有 3 种:
1 核酸杂交 ② 免疫学杂交检测 ③ cDNA 同胞选择
近年来随着生物技术的不断发展,出现了许多克隆新基因的方法和手段,如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术,主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5'和3'端,包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善,克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3' 阿尔及利亚地震端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16-30MN-3',M=A/G/C;N=A/G/C/T】,使引物定位在poly(A)
尾的起始点,从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5' 端加尾时,采用poly(C),而不是poly(A);改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温(60℃ -70℃)有效地逆转录mRNA,从而消除了5'端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。