1. primers design
这是最重要的⼀步。理想的，只同⽬的序列两侧的单⼀序列⽽⾮其他序列退⽕的引物要符合下⾯的⼀些条件。 a. ⾜够长,18-24bp，以保证特异性.当然不是说越长越好，太长的引物同样会降低特异性，并且降低产量；
b. GC% 40%~~~~60%窦蔻流浪记
c. 5'端和中间序列要多GC，以增加稳定性；
d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC，或者最后5个有3个不要是GC；
e. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER
f. 避免3'端的错配
g. 避免内部形成⼆级结构；
h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算，但在检测互补和⼆级结构是要加上它们；
i. 使⽤兼并引物时, 要参考密码⼦使⽤表，注意⽣物的偏好性，不要在3'端使⽤兼并引物，并使⽤较⾼的引物浓度(1uM-3uM)；
李植j. 最好学会使⽤⼀种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al。
引物的另⼀个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分⼦时的温度.Tm对于设定PCR退⽕温度是必需的。在理想状态下，退⽕温度⾜够低，以保证引物同⽬的序列有效退⽕，同时还要⾜够⾼，以减少⾮特异性结合。合理的退⽕温度从55℃到70℃。退⽕温度⼀般设定⽐引物的 Tm低5℃。 设定Tm有⼏种公式。有的是来源于⾼盐溶液中的杂交，适⽤于⼩于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的⽅法是近邻分析法。这种⽅法从序列⼀级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。⼤部分计算机程序使⽤近邻分析法。
根据所使⽤的公式及引物序列的不同，Tm会差异很⼤。因为⼤部分公式提供⼀个估算的Tm值，所有退⽕温度只是⼀个起始点。可以通过分析⼏个逐步提⾼退⽕温度的反应以提⾼特异性。开始低于估算
的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提⾼退⽕温度。较⾼的退⽕温度会减少引物⼆聚体和⾮特异性产物的形成。 为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使⽤较低的退⽕温度⽽表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退⽕温度设定为⽐最低的Tm低5℃
或者为了提⾼特异性，可以在根据较⾼Tm设计的退⽕温度先进⾏5个循环，然后在根据较低Tm设计的退⽕温度进⾏剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得⽬的模板的部分拷贝。
2. stability of primers
定制引物的标准纯度对于⼤多数PCR应⽤是⾜够的。
引物产量受合成化学的效率及纯化⽅法的影响。定制引物以⼲粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为
100µM。TE⽐去离⼦⽔好，因为⽔的pH经常偏酸，会引起寡核苷的⽔解。引物的稳定性依赖于储存条件。应将⼲粉和溶解的引物储存在-20℃。以⼤于10µM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个⽉，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。⼲粉引物可以在-20℃保存⾄少1年，在室温（15
℃到30℃）最多可以保存2个⽉。
3. optimize reactants concentration
a. magnesiom ions
Mg离⼦的作⽤主要是 dNTP-Mg 与核酸⾻架相互作⽤并能影响Polymerase的活性，⼀般的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离⼦的浓度，对实时定量PCR，使⽤3到5mM带有荧光探针的镁离⼦溶液。
b. 其他的离⼦
NH4+ K+都会影响PCR，增加K+的浓度后, 会因为中和了核酸⾻架上磷酸基团的负电荷⽽影响退⽕的温度，从⽽降低了PCR的严谨性(stringency)，NH4+也有相同的作⽤. MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, ⼀种是加Mg的⼀种是已经混合了(NH4)2SO4的，当然, 过⾼的阳离⼦浓度(KCL>0.2M)时, DNA在94度根本不会发⽣变性, 当然也就⽆从谈起PCR了。
c. polymerase
郑州 大学
不同公司的酶效有所不同，需要operator⾃⼰掌握适合的酶的浓度，⼀些⾼保真没的效率要远远低于T
aq polymerase，所以可能需要的酶的量也要⼤⼀些. 另外, ⼀般的情况下，变性的温度可以使⽤90~92度, 变性的时间也可以缩短，从⽽保证polymerase的活性。
三棵树苏童d. template
50ul PCR SYSTEM
human gDNA 0.1ug-1ug
E.Coli 10ng-100ng
LamadaDNA 0.5ng-5ng
Plasmid DNA 0.1ng-10ng
4. termperature
a. denaturation
常规是94度5分钟, GC Rich的摸板是95度5分钟，除了GC Rich外, 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时给予较长的时间,⽽取消开始的denaturation。
反倾销条例b. annealing
重点到了：⼀般情况下, 是从55度开始.根据情况配合以Mg离⼦浓度进⾏调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退⽕的时间在30-60S, 时间短⼀些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在 annealing temp.时也会有⼀些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极⼤的增加⾮特异性扩增的风险，另外，在对于⼀些困难户, ⽐如从gDNA⾥扩增⼤⽚段, 还可使⽤two step PCR。
5. touchdown PCR
原理很简单，但的确是⼀个很有⽤的⽅法。举个例⼦，ANNEALING TEMP. 55度
94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s
72 1min 2cycles 94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 94 30s
51 30s 72 1min 2cycles 94 30s 50 30s车险费率市场化改革
72 1min 20cycles 72 5min
6. hot start PCR
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提⾼PCR特异性最重要的⽅法之⼀。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进⾏PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退⽕温度时会产⽣⾮特异性的产物。这些⾮特异性产物⼀旦形成，就会被有效扩增。在⽤于引物设计的位点因为遗传元件的定位⽽受限时，如site-directed突变、表达克隆或⽤于DNA⼯程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常⽤⽅法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种⽅法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除⾮特异性产物的扩增。
热启动通过抑制⼀种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加⼊Taq DNA聚合酶，在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，⼿⼯加⼊polymerase，但这个⽅法过于烦琐，尤其是对⾼通量应⽤，并容易造成污染。其他的热启动⽅法使⽤蜡防护层将⼀种基本成分，⼊镁离⼦或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化⽽把各种成分释放出来并混合在⼀起。有很多公司提供这样的酶。
ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)
Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)
Magnesium wax beads (Stratagene).
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像⼿动热启动⽅法⼀样，蜡防护层法⽐较烦琐，易于污染，不适⽤于于⾼通量应⽤。还有⼀种⽅法是使⽤inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样polymerase⼜被激活了。
7. Booster PCR
我们知道1ug human genomic DNA ⼤约在3X10 5幂个模板分⼦，这样的模板分⼦数⽬可以是引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低,⽐如低于100个分⼦时, 引物和模板之间就很难发⽣反应. 引物容易⾃⾝进⾏反应形成⼆聚体.这样就有来了个booster PCR 我⼀直不到合适的词来翻译这个booster。
具体是这样的.开始⼏个cycles保持primer的低浓度，保证primer:template的molar ratio在10 7~ 10 8. 以确保开始扩增的准确性.然后booste Primer的浓度到正常的⽔平
8. 循环数和长度
确定循环数的基本原理是: 产物能够保证你进⼀步分析操作的最⼩循环数.因为过多的循环数容易造成ERRORS和⾮特异性产物的积累产物的量不够, 优化的⽅法有:
1. 增加TEMPLATE
2. 增加循环数
如何确定循环数，有⼀个⽅法.
做⼀个PCR体系,40循环,50ul, 分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,⼀起跑电泳分析.从⽽确定最佳的循环数；另⼀个会影响PCR特异性的是PCR cycling时在两个温度间变化的速率(ramping rate).当然是越⾼越好.不过咱们⼤部分条件有限，就那么⼏台PCR仪，也没有多少挑选的余地。
9. thermal cycler
PCR仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使⽤后需要调整PCR仪，以保证其能够到达正确的温度.现在的PCR仪基本上都有⾃检功能(self-diagnosis)。
10. PCR additives
附加物或者说enhancer实在是多种多样. 基本上包括⼏类, 能够增加反应退⽕效率的化学因⼦, DNA结合蛋⽩和⼀些商业试剂. 基本的原理不外是增加引物退⽕特异性，减少错配, 增加产物的长度和产量。
在GC Rich情况中, additive可以造成配对碱基间的的不稳定，从⽽提⾼扩增的效率.⽽在另⼀种情况下,additive由于造成错配的primer-template复合物的极⼤的不稳定, ⽽提⾼了扩增的忠实性.要注意的是，没有万能的enhancer全部通⽤，需要你根据⾃⼰的情况，最好结合gradient pcr选择最优条件。
dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%
formamide at 5%
trimethylammonium chloride 10-100uM
detergents such as Tween 20 0.1-2.5%
polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%
glycerol 10-15%
single stranded DNA binding proteins
Gene 32 protein 1nM
7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP
Taq Extender (stratagene)
Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)
Q-solution(Qiagen)
要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性，所以需要scouting出最适的浓度。
11. Template DNA preparation
提取DNA时的试剂会抑制PCR反应的顺利进⾏.因此需要对TEMPLATE DNA进⾏纯化.特别是SDS(<0.01%) 的情况下就能强烈抑制PCR的进⾏. 可以加⼊⼀些nonionic试剂，如Tween, Nonid, Trition之类的反过来抑制SDS。还有proteinase K也要除⼲净, 不然会降解polymerase。
12. Nested PCR
简单点说设计两对引物, ⼀对是长的, ⼀对是包含在长引物内的, ⽤长引物扩增的产物作为第⼆次扩增的模板，这样可以增加产物的量. ⽽且可以减少⾮特异性带和错配的情况。
增加PCR的保真性。
⾼保真酶
⾼温DNA POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和⼀些阳离⼦的存在情况下，在特定的引物指导下按3'-5'⽅向合成DNA.包括3种类型：
a.5'-3'⽅向的DNA合成能⼒，没有3'-5'⽅向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的合成能⼒强，因为他不纠正合成中出现的突变
b.与a类似，有合成活性，没有3-5的外切活性.但他们能以RNA为模板，合成DNA. 如Tth DNA Polymerase
c.有DNA聚合活性，没有逆转录活性，但有3-5⽅向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提⾼忠实性。但是这些聚合酶的产量⽐Taq DNA聚合酶低。
酶的混合物
将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第⼆种聚合酶混合在⼀起可以获得⽐单独Taq DNA聚合酶⾼的忠实性，并可以得到⾼产量及扩增长模板。
其他因素
除了酶，⾼浓度的dNTP或镁离⼦会降低忠实性。将dNTP的浓度从200µM降低到25-50µM可以增加精确度如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。进⾏较少的PCR循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数⽬和产物长度就会增加突变可能性。
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