测序常见问题及解决策略
一、PCR常见问题
PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻原因：
1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丧失过多；④模板核酸变性不彻底。 2）酶：酶失活或反响时忘了加酶。
3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低那么影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
4）反响条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。 爱白网
5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 2.假阳性
假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。常见原因有：
1）通往大国之路引物设计不适宜：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因此在进展PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
2）教育财会研究靶序列或扩增产物的穿插污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的穿插污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样内或溅出离心管外。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
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3.出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶那么不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当进步退火温度或采用二温度点法。裂隙制造者
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