多重PCR攻略
阿尔福斯 多重PCR能够在提高通量的同时节省样品降低成本，它需要耗费更多的时间和精力，同时也会给用户回报更丰富的数据。本文介绍了一些实验技巧和商业化工具，希望能帮您轻松获得好结果。
PCR的重要性毋庸赘述，这一诺贝尔获奖技术的普及带动了现代基因组学、鉴定技术、医疗诊断等领域的发展。如今，PCR几乎是每个实验室必备的通用技术，不过要跑好一个PCR墨国际
也并非那么简单，由于PCR反应很灵敏，PCR的效果很容易受到污染和脱靶效应的影响。我们在设计PCR实验时须得将引物设计、反应条件和酶的选择一一考虑周全。这一点在多重PCR中尤为明显，因为多重PCR需要在一个管中同时检测多个目标（通常二至五个）。多重PCR应用也很广泛，可以用来做基因表达分析、SNP分型、STR分型等鉴定以及病原菌检测等等。 多重PCR系谱的反应数相对较少，所消耗的试剂也较少，是一个颇为经济的选择。人们往往选用多重PCR来处理临床样本等珍贵样本，或者用来增加实验通量，每个样本所需的孔少了，那么一个微孔板自然就能容纳更多的样本。
多重PCR的挑战
传统PCR反应体系包括模板DNA、两个扩增引物、酶和缓冲液，一般最后通过凝胶电泳来检测所得的扩增产物。定量PCR除上述元素之外，还需要荧光探针以便检测反应的进行，不过就不需要进行凝胶电泳了。
从一般PCR到多重PCR，其实验设计的难度也随之翻倍。如果说扩增一个片段需要三条引物，那么两个片段就需要六条，三个片段需要九条，以此类推。这些引物既不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。此外，我们还要考虑同时检测不同的扩增子，要么就使不同扩增子大小不一以便凝胶电泳，要么就让它们带上不同荧光染料以便区分。更麻烦的是，多重PCR中的不同扩增片段还会互相竞争资源，其结果是高丰度模板能够被很容易的检测到，而低丰度的模板彻底沦为背景。
上述困难都是进行多重PCR的绊脚石，“大多数人都嫌太麻烦了，”Life Tech的资深科学家Jonathan Wang说“有许多客户对多重PCR感兴趣，但遇到这些麻烦之后，他们都选择了放弃，”安捷伦公司的产品经理Laura Mason补充道。
实验设计小tips
其实假如咱们迎难而上，还是有许多工具和小窍门可以帮得上忙的。NEB输液恒温器的资深科学家Nicole Nichols为正在设计多重PCR反应的研究者们推荐了以下五条基本原则。
原则一A：引物设计
“引物设计这一步是没法跳过的，” Nichols说。“从一开始就好好注意细节，最终将能为你节省很多优化时间。”
她推荐引物设计得比一般稍长一点（24–35 bases），解链温度稍高一点（65 °C以上），并且GC含量控制在50–60%。当然除此以外，PCR引物设计的标准规则是肯定要遵守的：保持几对引物解链温度相似、避免互补序列、避免3’端出现超过3个连续的G或C，以及以及验证、验证、再验证。
多重定量PCR不能用SYBR Green等插入染料，探针法是唯一的选择，例如Life Tech公司的TaqMan®探针或者IDT公司的PrimeTime® 探针。Bio-Rad公司的经理Keith Cockrum建议将这些探针的解链温度设计得比扩增引物的高7–8 °C。“我们要让探针先退火，”他解释说，要不然序列就会在没有探针的情况下进行扩增，他将这种无法检测到的扩增反应称为“
endogenous PCR”。“这是我们想要的特异性PCR反应，我们只是无法检测到其发光，”他解释道。
原则一B：引物验证
引物验证必不可少的步骤，Cockrum建议，首先将每对引物分别在模板上进行测试，这里的模板指对照样本，例如安捷伦公司的QPCR Reference Total RNA。可用SYBR Green熔解曲线分析引物对是否扩增出单一产物。另外还要引入温度梯度，以确定所有引物都能起作用的温度范围。如果有一对引物不能与其他引物一同起作用，她建议直接放弃这对引物重新开始设计，“放弃并重新设计其实比不断优化要好的多。”
如果要做多重定量PCR，Cockrum建议先在单重反应中测试探针，用一系列稀释度来确定每个探针的动态区域。最后再把所有元素组合到一起，确保各自的特异性、敏感性、动态区域等没有受到影响。“如果将以上都进行了论证，你就会拥有一个非常棒的多重PCR实验，”Cockrum说。
原则二：引物浓度
Nichols推荐的第二项原则是，保证每个引物浓度都低于单重PCR中的浓度，否则“反应中的总引物浓度会就会太高”。传统PCR反应中引物浓度为0.2 μM，那么我们可以试试0.15 μM（引物浓度范围通常在0.05 μM至0.4 μM之间）。
原则三、四、五：优化dNTP、MgCl2、聚合酶和盐的浓度
现在剩下的就是调整反应条件了。要一次进行这么多种反应，我们当然不想在反应中缺了哪个组分。一般多重PCR需要更多的dNTP、镁离子和聚合酶。Nichols推荐使用0.3 mM dNTP（而非标准的0.2 mM）、2.5 mM Mg2+（而非1.2至2 mM）以及每50μL反应体系5 units聚合酶（而非1.25 units）。最后再试试盐浓度，“在优化的时候，增加盐总会有帮助，尤其能增加特异性。”
PCR master mix含有缓冲液、盐、dNTP、Mg和聚合酶，如果我们使用常规1.25× 或1.5×的PCR mastermix就已经差不多做到了上述原则的三至五。另外，您还可以选用转为多重PCR优化的产品，例如NEB的多重PCR 5× Master Mix、Bio-Rad的iQ™ Multiplex Powermix、或者安捷伦的Brilliant Multiplex QPCR Master Mix。
据安捷伦的Mason介绍，Brilliant Multiplex QPCR Master Mix是经过专门设计的，能够很好的解决同一管中不同反应相互竞争的问题。如果一个目标片段出现1000次，而另一个目标片段只出现了10次，那么后一个片段就很容易沦为背景。“我们的多重PCR王学左派试剂盒能够在同一个管中准确定量低丰度和高风度的目标片段，克服偏向性，”Mason说。
我能扩多少目标片段
一般来说，最多能在同一个管中同时检测到五个目标片段，这既是出于引物设计的考虑，也是由多重定量PCR的硬件条件决定的。实时荧光PCR仪通常最多检测4至5个颜通道，其中一个可能还要留作参考通道。凝胶电泳虽然不受此限制，但多引物一同作用仍然存在困难，因此还是最多达到五重PCR。 “设计更多是极具挑战性的，”Cockrum说。
多重定量PCR的染料
能进行多重定量PCR的仪器包括：Life Tech公司的QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System、安捷伦公司的Mx30005P等等。据Cockrum介绍，Bio-Rad公司的CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System具有五个通道，每个通道配有单独的激发光源
和检测器。在典型配置中，通道1用于FAM，通道2用于HEX或VIC，通道3用于Texas Red或ROX，通道4用于Cy5，通道5用于Quasar 705。目前最流行的选择是HEX、FAM和VIC，而FAM/HEX和FAM/VIC是用的最普遍的。Life Tech除了生产VIC外，近期又发布了两个新染料ABY和JUN以及一个新passive reference dye——Mustang Purple。
Cockrum建议将染料强度与模板丰度结合起来，用最亮的染料（通常是FAM）配最少的模板，用最黯淡的染料（例如Cy5或Quasar 705）配丰度最高的模板（如看家基因）。
更多重的PCR
当然，引物设计是多重PCR的最大障碍，不过一旦克服了这一障碍我们就能进行更多重的PCR反应。安捷伦的MassCode技术就能够超越定量PCR仪带来的硬件限制，安捷伦公司将这一技术推荐给那些想要同时筛选十个以上目标片段的用户，例如可以用来检测病原体。
MassCode技术融合了多重PCR和LC/MS技术。首先，开展多重PCR，每个引物都带有一个化学标签（tag）。随后纯化PCR产物，并上样到LC/MS系统中，切除标签用质谱仪进行
检测。2011年，安捷伦公司的科学家就进行了14重反应，对多种沙门氏菌进行检测和分型。
Promega公司发明的短串联重复基因座的多重扩增技术，为STR技术在人类遗传鉴定领域的广泛应用奠定了雄厚的技术基础。该公司推出的PowerPlex®系列产品采用了快速扩增循环技术，大大缩短了样品扩增时间，并具有高的抑制剂耐受性及灵敏性，在短时间内可收集到样品更多的基因座信息，具有强大的信息兼容性。尤其PowerPlex®常染体试剂盒含有的专利基因座PentaD及PentaE舌骨，具有低影子带，高多态性的特性，大大提高了PowerPlex®系列产品的个体识别能力。PowerPlex®系列产品已广泛应用于疑难案件处理、亲子鉴定及犯罪人员数据库建设等法庭科学鉴定领域，同样引起进行人源细胞系鉴定的实验室的高度关注。（更多信息）
引物设计软件
怎样设计能够相互兼容的引物呢？简而言之，用软件。现在市面上有很多免费的引物设计软件，例如IDT公司的RealTime PCR calculator。Nichols选择的是Primer3 (MIT, Cambridge, MA)，随后通过UCSC Genome Browser再次筛选潜在的引物序列，以避免脱
靶。
此外，也有不少商业化工具可供选择，例如Premier Biosoft家的Beacon Designer（Bio-Rad公司有提供哦）。这个软件能够通过全基因组BLAST搜索来避免重复序列，通过结构预测来避免高度折叠区域，通过配对测试来剔除可能的引物二聚体。据该公司介绍，这一软件能够大大帮助多重PCR的引物设计，从上百万种潜在组合中挑选出少量符合标准的引物呈献给用户，以便用户进行实验验证。
多重PCR能够在提高通量的同时节省样品降低成本，它需要耗费更多的时间和精力，同时也会给用户回报更丰富的数据。如果您有兴趣进行多重PCR，那么希望本文中介绍的技巧和产品能够使您的实验更轻松，得到更好的结果。
参考文献：
1. !--?xml:namespace prefix = st1 ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags" /--Richmond, G.R.; Khine, H. et al. MassCode liquid arrays as a tool for multiplexed high-thr
oughput genetic profiling.PLoS ONE 2011, 6(4):e18967.
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