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DNA测序常见问题分析及解决办法总结

常见问题	具体情况	可能的原因	处理办法	备注
样品准备问题	菌培养不好或失败	抗性不对或菌已死	核对抗性，尽可能提供载体信息。
		或菌培养条件特殊	重新提供菌液，或提供2ug纯化质粒。
	质粒提不出	质粒拷贝数极低或	客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。
		培养方式不当
	质粒产量很低	低拷贝数质粒或	客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。	棕黑锦蛇
		培养方式不当
	自带质粒或已纯化PCR产物量极低	是否为电泳法定量，	质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul。	测OD值法不可靠,电泳检测
		总量是否足够	已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
测序出现双峰或信号中断	双峰	重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复	用反向引物测互补链。	此类问题主要与样品有关
		质粒测序在插入序列中出现套峰	可能是样品非单克隆，挑其他克隆测序。
		PCR产物测序中，某一点后序列变乱	可能是存在移码突变，这是正常的，也可以克隆后测序。
		PCR产物中一个或多个位置有套峰	序列中存在突变，这是正常的，也可以克隆后进行测序。
		PCR产物测序前部分双峰	引物二聚体污染或产物不纯，克隆后测序。
		质粒测序时整个结果双峰	引物特异性不好，序列中存在通用引物的同源序列；改用其他引物测序。
		质粒和PCR产物测序出现双峰	引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化，或纯化不好。重新合成引物测序。
	信号迅速衰减或中断	模板GC二级结构区后	难以得到好的测序结果，亚克隆成较小的片段进行测序
		模板GT二级结构区后	测反向互补序列，AC结构不影响测序
		严重的重复结构	测反向互补序列
		模板特性决定的	根据具体情况决定
	信号极弱或无信号	模板质量差	重新提供菌液或纯化PCR产物	小站歌声
		质粒样品：引物不符	尽量提供载体详细信息，核查引物

		引物不适宜测序	测序引物比PCR邮件合并引物要求高，随机引物和简并引物不能用于测序，较长的PCR引物也不能用于测序。重新设计引物测序，对PCR产物而言建议克隆到载体上用通用引物进行测序
		质粒产量极低南京信息工程大学学分制管理系统	山中避雨教案客户自己提供2ug纯化好的质粒
		PCR产物定量极低	重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化
测序结果正常，与预期不符	不到引物	质粒模板	检测是否为空载体，从其互补链上寻，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。	中国金融管理学院

		PCR模板	不可能到所用的测序引物，短片段可以从互补链上到另一段的引物，长片段由于测不通，无法到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经克隆后进行测序。

	结果完全不对	请提供详细资料我们会根据结果具体分析。

本文发布于:2024-09-25 04:36:33，感谢您对本站的认可！

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