基因克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义DNA段同能够自我复制的载DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此基因克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA技术。 铁二院西安分院
根据这个定义，于是选择和使用不同的方法，最后得到含有目的基因片段的菌株。针对目的基因的来源不同，可以选择多种克隆方法，但并没有放之四海而皆准的方法，要针对自己的目的基因的特点采取相应的且合适准确的方法来获得目的基因的克隆。
1 当目的基因的序列完全已知时。则可以根据文献上所查到的基因的注册序列号到相应的网上数据库去查该基因的全序列结构信息，例如最常用的美国NCBI网站上的Genbank数据库。然后查到相应的目的基因的核苷酸序列信息和其来源。然后使用生物信息学软件对基因的序列进行分析，设计通过PCR反应来扩增目的基因的核苷酸引物，并将设计的引物序列发给生物技术公司合成，最后得到引物核苷酸并用纯水进行合理的稀释。 接下来将采集含有目的基因的生物标本材料，使用合理的方法提取生物标本的基因组
并进核酸浓度与纯度的测定，由于生物体的核酸从化学性质上来讲主要分为DNA和RNA两种，所以提取基因组后针对基因组的选择要尽可能去除另一种核酸的干扰与污染。然后根据基因组的质量，浓度，PCR扩增设计引物的结构，目的基因的长度等因素设计PCR反应的条件，反复试验以到能够通过PCR方法来准确扩增目的基因的最佳反应条件。
在目前的PCR反应中所采用工具酶为Taq DNA聚合酶，通常所用的Taq DNA聚合酶具有一个生物反应特性，在其扩增的PCR产物上，其3’末端总是会带有一个非模板依赖性的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A( dATP), 因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性，故可以针对这一点采取两种克隆策略。其一，可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接；其二，可直接与一些T载体（切口处含有一个突出T碱基的克隆载体）连接并克隆。
与载体的连接反应结束后，可与感受态细胞株系（如大肠杆菌）进行转化反应。利用克隆载体上所携带抗性基因或是其他筛选标记基因的插入失活来选择阳性克隆菌斑。挑去菌斑用液体培养基（包括此步在内以后实验，对阳性克隆菌株都要加以一定的选择压）。并进行质粒的提取，鉴定并送往生物技术公司测序。以保证克隆基因的核酸序列的正确性。
2 化学合成法是指通过化学的方法人工合成所需要研究的DNA序列的方法。到目前为止应用计算机控制的全自动核酸合成仪可以按设计好的序列一次合成100~120bp长的DNA片段。因此一定长度的基因产物是可以利用化学方法合成的，但前提条件是已知的基因的核苷酸序列，至少能根据目的基因对应的蛋白质氨基酸序列推导出编码基因的核苷酸序列。由于一次合成反应的核苷酸长度有限，对于合成长的片段，可先合成DNA短片段，然后按顺序连接短片段，最后合成一个完整的基因。常用来组装大片段的方法主要有两种：
一个是先将化学合成的一条寡核苷酸片段激活，使其带上必要的5’磷酸基团，然后再与另一条部分互补的寡核苷酸片段退火，形成带有黏性末端的双联寡核苷酸片段。吧这些双链寡核苷酸片段混合在一个试管里，加入T4DNA连接酶，使他们彼此连接。
流体力学实验另一个是合成较长片段经部分重叠后连接，这种方法可以减少合成的寡核苷酸片段的数量，通过合成两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段，混合后退火，两片段3’端互补区配对重叠，加入DNA聚合酶（如Klenow酶）后，在酶催化作用下，迅速地合成出相应的互补链。虽然在理论上讲，应用这种方法可以合成大片段基因，并可以任意制造、修饰基因。但实际效果却存在三个主要问题：一，退火过程中难以消除那些不必要的杂交作用，从而
产生非特异性产物。二，大片段的基因结构复杂，不可避免地存在二级结构，从而干扰聚合酶的作用。三，突变频率高，平均每隔500bp~800bp就会出现一个突变。使得这种方法还是有相当的局限性的。
不过，由于是按设计好的序列来合成基因，尤其方便了针对基因突变（一级结构水平）的研究，密码子偏爱性的优化等实际使用等实验。在目的基因合成后，与常规PCR方法相同，通过转化、筛选和鉴定来制备目的基因的克隆。这里不再复赘。
3 RT-PCR。由于生物体内的DNA并不是全部都能转录并翻译的序列，往往还存在一些非结构基因，在真核生物中还存在断裂基因的现象，即内含子。而在原核生物中则含有多顺反子现象，某些顺反子还发生一定程度的重叠，所以在研究这些类基因的同时，要根据实际情况查清楚目的基因的表达时间及组织，同时也将目的基因的来源由DNA转到其相对应的mRNA上。
利用这种方法来克隆目的基因，引物的设计与已知基因序列设计的特异引物相同。但扩增的模板则是在生物体特定时间及组织中所表达的mRNA所反转录生成的cDNA。所以首先要清楚目的基因的表达性质，若目的基因为管家基因，即在各个生理期表达量差异均不大，
则只需要出生理活性最好的组织来提取分离RNA，若目的基因为调控表达，则要寻其表达丰度最大时期的相关组织进行RNA的提取，有时候这类基因与生物体的生理调控有关，可以适当的给予一些外源刺激以提高表达丰度，保证RNA中目标mRNA的获得，以保证后续反转录过程中目的基因cDNA片段的准确性和完整性。
接下来对生物体RNA的提取，注意RNA提取过程中的注意事项以保证目的m RNA片段的获得。同时也要防止生物体自身中DNA序列的污染。
通常以mRNA作为模板，反转录酶作为工具酶，d NTP为原材料，常采用三类引物合成相应的cDNA作为PCR反应的模板。这三类引物是随机六核苷酸引物；多聚寡核苷酸引物（oligo(dT)）和基因特异性引物。
用随机六核苷酸引物逆转录方法的特异性最低。随机引物可以与mRNA上多个位点配对结合，产生短的、部分cDNA片段，因此该方法适合用于获得mRNA5’端序列或具有二级结构的RNA模板序列，不适合全长cDNA序列的克隆。
用多聚寡核苷酸引物（oligo(dT)）作为引物进行逆转录的方法特异性高于随机引物的方法。
由于oligo(dT)可以和大多数真核生物m RNA3’端的poly(A)结合，因此该方法适合用于大部分真核m RNA的逆转录反应。常用的多聚寡核苷酸引物（oligo(dT)）为长度12~18个脱氧胸腺核苷酸引物（T）组成的多聚形式。
当使用反转录酶时要注意反应温度选择，目前常用的逆转录酶多属禽源的或鼠源的。来源不同反应温度也不一样，注意区分。
当用反转录酶反应后，可根据实际需要选择是否合成第二条互补DNA链，若需要建文库则要利用RNAasesH活性消除杂交链中的RNA链，在严格地合成互补的第二条DNA链。若是用基因特异性引物通过PCR反应扩增目的条带则没有必要合成第二条互补DNA链，只要扩增到目的条带既可以了。
后续的操作与正常的PCR反应相同。不再重复。
4 使用兼并引物（Degenerate Primer）PCR扩增目的条带。相比较基因特异性引物扩增目的条带的方法。该方法在模板来源上没有什么变化，只是对引物的核苷酸序列进行了部分改动。尤其是在扩增新的同源基因时，该方法显得特别有用。
密码子具有兼并性，单以氨基酸顺序推测编码的DNA序列是不精确的，但可以设计成对兼并引物，扩增所有编码已知顺序的核酸序列。用兼并引物时寡核苷酸中核苷酸序列可以改变，但核苷酸的数量应相同。兼并度越低，产物特异性越强，设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3big 4大四喜’末端兼并，针对兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的扩增、克隆和序列分析。现已成功地克隆了猪尿酸氧化酶基因、糖尿病相关肽基因和哺乳动物与禽类的嗜肝病毒基因。用脱氧肌苷（deoxyinosine；DI）引物进行PCR，可以代替编码蛋白的多种兼并密码子中的兼并碱基，DI的特异性主要受cDNA浓度影
理论上说：由氨基酸回导核酸序列，同时考虑到宿主使用密码子的偏爱性，以减少兼并度，但是这样得到的兼并引物的兼并密码子比较多，3’端尽量不使用兼并密码子。
简并引物设计原则： 选择高度保守的序列作为引物。如果可能的话，选择在基因家族内和不同种属间都保守的序列。选择兼并度最小的序列。含有氨酸和甲硫氨酸的肽段为首选，因为其密码子是唯一的。尽可能不用含有亮氨酸、精氨酸、丝氨酸的肽段。若引物序列高度简并，利用脊椎动物基因组中CpG二核苷酸的较低丰度，可望降低兼并度。并结合密码子优先表，或在有兼并度的地方引入次黄苷来降低兼并度。3’端尽量不使用兼并密码子。如果蛋白中有两个以上的区域高度保守，可构建几套PCR引物，以便使用“巢式”PCR来增加特异性。
同时也要对PCR反应条件进行一定程度的优化： 退火温度 总的来说，退火温度越低，非特异性扩增的可能性越大。低至37度的退火温度也可被采用于高度简并的引物进行PCR扩增。降落 PCR也可以减少错误扩增。扩增的循环数 过多循环数导致非特异性带的产生；可以每5个循环取一定样品来检测扩增的特异性。降温时间 不同的PCR仪效率不同。较长的降温时间有利于错配杂交的产生。PCR缓冲液成分 主要在于乌兹别克斯坦电影Mg2＋离子的浓度。
扩增得到的条带经常用策略与T载体连接并转化，鉴定。送往生物技术公司测序，为确保实验结果的精确性，应该将获得的目的基因条带与原材料基因组杂交验证。
4 DDRT-PCR。现已知道，真核基因mRNA分子的3’端都带有多聚腺苷酸尾巴，即poly(A)尾。利用这一特定序列结构，以oligo(dT)为引物可以合成出与mRNA互补的cDNA。仔细分析mRNA分子3’端序列结构发现，除了碱基情况为A外，最多只剩下三种情况（G\C\U）。于是可设计12种不同的引物，称之为锚定引物。是用11或12个连续的T加上两个3’端的特定脱氧核苷酸（也常称为锚定脱氧核苷酸）组成，用5’—T11MN或5’—T12MN通式表示。其中M是除了T2019最新国产理论以外的任何一种核苷酸（A\G\C）, 而N则是任何一种核苷酸(A/T/G/C)，故锚定引物有二级医院12种组合形式。这样，每一种此类锚定引物，都将能够把总mRNA体的1/12逆转录成mRMA—cDNA杂交分子，即将整个mRNA体在cDNA水平上，分成数目大致相等的但序列结构不同的12份亚体。
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