8F | AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG |
1492R | 蓝鲸紧急出动 GGT TAC CTT GTT ACG ACT T |
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或
sgF | AGAGTTTGATCATGGCTCAG |
sgR | TAGGGTTACCTTGTTACGACTT |
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8F/1492R使用最普遍,效果的确不错;但我们的经验是sgF/sgR(上海生工公司扩16S推荐的引物)效果更好。这2对引物对应的PCR产物都在1.5kb左右。
16S V6区通用引物:
V6-967F | CAACGCGAAGAACCTTACC |
V6-1046R | CGACAGCCATGCANCACCT |
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这对引物也是我们用过的,效果很好。对应的PCR产物约90bp(V6区平均长度80-100bp,一说79bp)。
引物到后,先在迷你离心机上短暂离心,将黏附在管口、管壁、管盖的核苷酸粉末甩到管底,然后在超净台操作(因为16S序列所有细菌里都有,扩增时很容易混入杂菌,因此本实验涉及的每一种试剂、耗材都要非常小心,保证无污染):按照引物合成单的说明,加入灭菌的TE缓冲液,如果没有,灭菌的双蒸水也行(注意每OD加入量不等于最终加入量,一般引物合成是2OD)。溶解核苷酸粉末后,用头吹吸混匀。取5μL溶液转移到另一个灭菌的EP管,加入45μL灭菌的双蒸水,即稀释10倍,此时引物浓度为10μM,也就是工作浓度。最好分装保存,避免多次使用导致反复冻融,造成引物不稳定。高四
环境污染与防治以genomic DNA为模板,最适模板量为0.1-10 ng,多了可能引发非特异性扩增,少了可能扩不出来,所以要先稀释。PCR体系建议25μL,效果远好于50μL。推荐用TAKARA的LA Taq(保真度是普通Taq的6.5倍,扩增效率也较高)或FINNZYMES的Phusion(保真度是普通Taq的50倍,pfu的6倍),以保证16S测序结果可信。
PCR体系:
模板 1μL
引物F 0.5μL
引物R 0.5μL
dNTP(10 mM) 0.5μL
LA Taq(5U/μL) 0.5μL
10×PCR buffer 2.5μL
灭菌水 19.5μL
总体积 25μL
模板 1μL
引物F 0.5μL
引物R 0.5μL
Phusion 12.5μL
灭菌水 10.5μL
总体积 25μL
注意:1、PCR加样过程要在超净台进行。操作前先开紫外灯30 min,关闭后再开风机10 min,再用酒精棉球清洁台面和双手,方可开始操作。
2、一定要做阴性对照(不加模板,其余成分都加)!
3、所用PCR管、头、水均须严格灭菌。
4、加样过程中,每一管管盖开的时间不要太久,加完立刻扣上盖子,再加下一管,避免交叉污染(genomic DNA浓度通常很高,在空气中容易逸散)。
5、加样在冰盒上操作,加完轻轻吹吸,短暂离心,保证各组分均匀混合。
PCR程序:
针对全长:
94℃ 4 min
94℃ 30 s
72℃ 90 s
72℃ 10 min
4℃ ∞
针对V6区:
94℃ 4 min
94℃ 30 s
72℃ 10 s
72℃ 5 min
4℃ ∞
注意:Phusion的扩增效率较农业生产资料市场监督管理办法LA Taq低,所以如果Phusiondpl扩不出,可适当增加3-5个循环数。
电泳检测:
配制1%(16S全长)或3%(V6区)琼脂糖凝胶——样品PCR产物和阴性对照PCR产物各取4μL,混合0.5μL 6×loading buffer点样,并点DL2000 Marker(16S全长)或50 bp ladder Marker(V6区)——1×TAE,115V,电泳45-60min——EB染15 min——紫外凝胶成像仪拍摄电泳照片
正确的结果应该是:1.5kb单一亮带(16S全长)或稍小于100bp(V6区)单一亮带,阴性对照无条带。