利用ITS进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。ITS是内源转录间隔区( Internally Transcribed Spacer)的英文缩写, 位于rRNA 编码基因18S,5. 8S和28S之间的小基因片段。其优点有: 具有高拷贝数，整个序列的长度在600～800 bp，利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；同时包含保守与变异序列, 能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，rRNA基因(rDNA)在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。这些rDNA高度保守地分布在染体的不同位置，在每个单倍染体基因组中的拷贝数超过200个，这使得保守区域能够很容易被扩增出来。每个重复的rDNA 序列的存在方式为由一前一后的18S rDNA 小亚基单元(SSU) , 5.8S rDNA, 28S rDNA大亚基单元(LSU)组成，已设计出通用引物来扩增ITS序列分析相关真菌种水平之间的差异。本研究通过丝状真菌ITS保守序列的扩增, 同源序列的对比分析 ，结合传统鉴定方法，对从土壤中分离筛选的一株丝状真菌进行了分析鉴定，并对鉴定结果和方法进行了比较分析。 种内变异还显示在rDNA基因间内转录间隔区Ⅰ和Ⅱ（分别为ITSⅠ和ITSⅡ）的片段大小上。ITS区在核糖体DNA中进化较快，可在同一属间甚至体间发生变化。其中ITSⅡ区在种间变异性较高（22％），种内变异性较低（＜3％）。选择的两对引物均以ITS区的序列为靶目标，其中
引物①（ITS1和ITS4）扩增的是ITSⅠ区、5.8SrDNA和ITSⅡ区的基因序列，可以鉴别出念珠菌属的3个菌种；
op07
引物②（ITS4和ITS86）扩增的是5.8S rDNA和28S rDNA之间的ITSⅡ区的保守顺序，可以鉴别出念珠菌属的7个菌种。因而笔者更推荐采用引物②，它不仅有很强的通用性，能识别更多菌种，而且具有更高的属种特异性。
1、通用引物①：
吴英案始末ITS1 5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG一3’
ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC一3’
通用引物②反论文
ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC一3’
ITS86 5'-GTGA ATCA TCGA ATCT TTGA AC一3’
2、反应体系（50μL）
10×buffer 5 μL
Mg2＋ 4 μL
dNTPs 4 μL 可以加到一起，再分装
上游引物（ITS4） 2 μL
vmas下游引物（ITS86） 2 μL 加完试剂后，稍加离心。
Taq酶 0.5 μL
文曲星NC3000ddH2O 30.5 μL
模板DNA 2 μL
3、PCR程序
94 ℃预变性 5 min
94 ℃ 50S
51 ℃退火 50S 30个循环
72 ℃ 2 min
72 ℃延伸 10 min
- 20 ℃保存备用, 1%琼脂糖电泳检测。
豫公网安备41160202000603
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