1 范围
本标准规定了鱼类肠道微生物样本的采集、分离、培养、鉴定及保藏等。 本标准适用于淡水及海水鱼类肠道微生物的研究。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 19489实验室 生物安全通用要求
GB/T 30744深海微生物样品前处理技术规范
SN/T 2632微生物菌种常规保藏技术规程
3 术语与定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
肠道微生物 intestinal microorganism
生长于动物肠道，并帮助宿主完成多种生理生化功能的微生物落。
3.2
16S rDNA
是编码16S rRNA的基因，16S rRNA为核糖体RNA的一个亚基，是系统分类研究中最常用的分子标签，可被用于菌种鉴定。
3.3
聚合酶链式反应 polymerase chain reaction
一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA/RNA片段，这种方法可在生物体外进行，不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。 3.4
Sanger测序 Sanger sequencing
即双脱氧链终止法测序，为第一代DNA测序技术，是一种常用的核酸测序技术，用于DNA分析，由英国生物化学家弗雷德里克•桑格于1977年发明。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline）
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）
OD：光密度（Optical Density）
羟基自由基
5 基本要求
5.1 实验室通用要求
实验室应满足GB 19489中关于一级或以上级别生物安全实验室的要求。
5.2 鱼类样本要求
鱼类样本应尽量保证鲜活，死亡鱼类样本最长死亡时间不应超过24h。
5.3 实验用具准备
一次性无菌手套、无菌眼科镊、无菌眼科剪、无菌PBS（配方见附录A.1）、2216E培养基(配方见附录A.2)、LB培养基（配方见附录A.3）、无菌水、无菌50mL离心管、医用托盘、75%消毒酒精、涂布棒等。
6 鱼类肠道微生物样本采集和保存
6.1 鱼类肠道微生物样本采集与储存
6.1.1 活体鱼类样本应先进行麻醉，之后，在超净工作台内，用75%的酒精对鱼体擦拭消毒。
6.1.2 将鱼类样品从泄殖腔处沿腹部剖开，用无菌PBS冲洗鱼类腹部，用吸水纸擦拭腹腔。
6.1.3 分离并剪下鱼类完整肠道，将肠道内容物全部挤到无菌离心管中，并将肠道内壁残留物轻刮于离心管中。
6.1.4 对肠道内容物进行称重，内容物总质量应控制在10g以下，按1g内容物加入3mL无菌PBS的比例进行稀释，震荡混匀，得到肠道微生物样本。裴开元
6.2 肠道微生物样本存储
肠道微生物样本应储存在2℃～8℃低温环境下，宜立即进行处理，保存期限不应超过一周。
7 鱼类肠道可培养微生物的分离、培养及鉴定
7.1 肠道微生物分离和纯化
7.1.1 肠道微生物分离
7.1.1.1 取100μL肠道微生物样本，用无菌PBS稀释到1000μL，制成10-1样品稀释液，震荡混匀，备用。
7.1.1.2 取100μL 10-1样品稀释液，用无菌PBS稀释到1000μL，制成10-2样品稀释液，震荡混匀，备用。
7.1.1.3 按上述步骤依次稀释获得10-3、10-4的样品稀释液，震荡混匀，备用。
7.1.1.4 取10-2，10-3，10-4样品稀释液进行固体培养基平板涂布，涂布平板宜28℃恒温培养，培养时间1～3天，每隔12h观察菌落生长状态。
7.1.2 肠道微生物纯化
7.1.2.1 观察涂布平板的生长情况及菌落形态特征，选择合适稀释度（约10～200个菌落）的平板挑选菌落，选择不同形态的单菌落编号后划线，于28℃恒温培养12 h～24 h。
7.1.2.2 观察划线培养菌落形态特征是否单一，对于形态结构不单一的平板继续挑单菌落并划线培养，直至获得菌落形态特征一致的纯培养单菌，并填写《菌落形态特征统计表》，参见附录B。
7.2 肠道微生物培养
挑取分离、纯化出的纯培养单菌落接种至液体培养基中，宜150rpm 28℃条件下恒温震荡培养至菌液OD600值达到0.6～1.0之间。
7.3 肠道微生物鉴定
7.3.1 微生物基因组提取
小学数学课堂教学的有效性对培养得到的菌液进行基因组提取，参照GB/T 30744内相关内容进行。
7.3.2 基因组16S rDNA基因扩增
对所提取菌株基因组的16S rDNA基因进行PCR扩增， 扩增引物及反应条件详见附录C。
7.3.3 PCR产物电泳检测
对扩增所得PCR产物进行电泳检测，步骤参见附录D。
7.3.4 PCR产物测序及序列比对
对检测合格的PCR产物进行Sanger测序，测序结果与EzBioCloud数据库进行序列比对，确定分离微生物的种类并参考附录E的信息记录表进行记录。
7.3.5 其他情况
对于测序比对没有结果的菌株，可进行生化鉴定，包括镜检、革兰氏染、接触酶试验、氧化酶试验等，根据实验结果鉴定菌株种属类别。
8 鱼类肠道微生物的保藏
8.1 肠道微生物保藏
菌种保藏参见SN/T 2632规范内容。
8.2 保藏微生物信息记录
参照附录E的信息记录表，对保藏信息进行记录。
附 录 A
（规范性附录）
缓冲液及培养基配方
表A.1给出PBS配方。
表A.1 PBS配方
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO40.24 g
三宽四有蒸馏水 定容至1000mL pH 值 7.4
表A.2给出2216E培养基配方。
表A.2 2216E培养基配方
蛋白胨 5g天高
酵母膏 1g FePO40.01g
陈海水 定容至1000mL 琼脂糖（固体培养基添加） 15g
pH 值 7.6 注：适用海水鱼肠道微生物培养
表A.3给出LB培养基配方。
表A.3 LB培养基配方
蛋白胨 10g
酵母膏 5g NaCl 10g
蒸馏水 定容至1000mL 琼脂糖（固体培养基添加） 15g
pH 值 7.6 注：适用淡水鱼肠道微生物培养
附 录 B
（规范性附录）
菌落形态特征统计表
表B.1给出菌落形态特征统计表。
表B.1 菌落形态特征统计表
有无菌种编号 颜 大小 形状 质地
晕圈有无
光泽
是否
湿润
是否
凸起
是否
透明
培养时间记录人力学与实践
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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