1、定量
PCR产物，如果达不到浓度标准，成功率低！因此，定量尤其重要！
如何定量？
上样量：测序公司用的大孔胶（是实验室常用小孔胶的2倍），电泳上样量是2ul，这样算来，PCR完毕，电泳上样量只需1ul就行。但实际情况，大家会觉得少了不好操作，也可以2ul点样。
定量：样品上样量和maker的量一定要相同，可以对比亮度（大致定量），也可以看看条带大小是否一致。建议样品和maker都点2ul。
一般来说，一个测序反应只能测700bp左右，因为一代测序仪大致能测700bp，具体长度与序列结构，操作水平，用的酶量（并不是越多越好，要适中）有关系，与酶的品牌没什么关 系，听说除了个别公司是自己配置，目前基本都是原装货。
注意：
a、无效序列：
网
测序前端几十个碱基（大多数30-70bp）和后续几十个碱基（大多数20个bp左右）是不可用的，如果需要把引物给测出来，建议做TA克隆，用通用载体引物测（等于是两端延长了，引物处于有效序列范围）
比如下图：
测序引物一看就是选下游引物（黄），因为上游引物离需要的片段（绿）太近，前面几十个碱基是无效碱基，会导致绿前端部分无效。
b、重复结构
单碱基重复例如aaaaaaaaa等，多碱基重复atatatatatatatat等，7、8个以上重复或者些不连续小重复（其他碱基也一样）和GC含量高或者低的（一般指65%以上或35%以下）就不太好测了，成功率比正常序列低，甚至低很多。
海城黑社会比如下图：测序引物一看就是选下游引物（黄），为什么呢，上游引物后面都各种小重复，GC含量特别低的区域（红）是测不过去的。
金东进
3、测序反应个数
由于一个测序反应只能测700bp左右，所以可以设置：单向测序（1个反应测通），双向测序（2个反应可测通），测通（2个反正测不通的情况，中间需要加测）
注意：有个别的序列特别长，所以需要的时间也特别长
好奇的宝宝会问：为什么不同时测，为什么要测完一个反应，再测下一个反应？
a、无参考序列
这个情况肯定是不行的，引物都没法设计，只能测一段再设计引物测序。
b、有参考序列
同时测序有风险，有时候引物设计好了，测序有时候刚好就差那么几个碱基，那还得补测，如果不在乎钱，是可以同时测的。
c、短片测序
200bp以下的建议构建载体测序，不然去头去尾，剩下没几个碱基了。
4、PCR产物质量
之前遇到一些同学，PCR产物质量非常好 ，测序基本没有问题。但还是需要注意以下几点：
a、引物不能有拖带，可以有多带（可以通过切胶解决），但就是不能有拖带，拖带哪怕很淡，都会影响测序质量。 b、引物杂质不能过多，杂质过多，也会影响质量。引物是干粉（虽然肉眼看不见），稀释前一定要离心，慢慢的打开盖子，沿管壁慢慢加入无菌去离子水，切不可粗手粗脚。
c、PCR过程中，实验室环境要干净（任何实验都需如此），头注意不要污染，不能把移液器倒过来倒过去，移液器一定要保持清洁，不然污染了头，会直接影响后面的实验，也不能一边唾沫横飞，一边实验。
d、巢式PCR（两对引物）和二次PCR（同一对引物），一定要备注：切胶，测序公司会帮你切胶纯化，去除杂质（这种情况，哪怕是单一条带，杂质也不少）。
作者琳琳猫----
一个会烹饪会写古文的耿直女子，浙江大学食品工程学硕士，曾就职于华大基因7年。有丰富的snp，甲基化，rna检测等方法学研究经验。
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