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引物在诊断学中主要用于扩增技术、cDNA合成、第二代测序和某些微阵列技术。只有PCR使用引物对组合，即两个可以在目标上下游退火的引物。这样，合成的核酸的大小就被确定了。可以使用以下引物的变体： 独特的引物使用独特的序列识别某个目标，在基因组或基因表达产物的其他位点上没有出现过。独特引物可用于PCR、测序和cDNA合成。独特引物可分为两类；完全匹配的引物和不匹配到一定程度的引物。后者可以专门设计，例如区分野生型和突变型基因组（错配鉴别）或能够检测一个（亚）物种或更高层次如家族的基因型中出现的一个或多个SNPs（错配耐受）。由于SNPs可以在复制过程中从新形成，特定的引物会失去其独特性。3′末端或附近的错配将在PCR中产生假阴性。 非唯一引物可用于各种类型。重复引物粘附在多个位点上。突出的目标序列是微卫星，如（CACA）n-repeat、UTR或RE位点。Oligo-dT-引物用于真核生物的cDNA合成。这些引物与真核生物mRNA的3′-聚A-序列杂交。随机六聚体是用于cDNA合成、「缺口」翻译和微阵列的比较基因组杂交的通用引物。
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特殊引物，主要是独特引物的变体，在设计独特的引物时，世界范围内可用的数据库，主要是GenBank，和搜索工具（例如BLAST-基本局部比对搜索工具）是必不可少的资源。现在，越来越多的物种、基因型、甚至个体基因组的完整序列都是已知的。
对于开发新的诊断性PCR，诊断问题的定义是至关重要的：
需要识别哪个目标？
目标是一个基因、一个非编码片段、一个特定的突变甚至是一个易位？
是想识别一个病原体、一个抗性基因还是一组相关病毒的毒力因子？
是否需要确定一个肿瘤的表型或基因型或一个偏离的甲基化？
对于所有这些目标，重要的是至少要知道独特引物退火点的序列。随后，重要的是了解目标的性质，包括开放阅读框架（ORFs）的存在、组成（GC含量、保守片段的存在（有少量碱基变化）、二级结构和限制位点）、遗传（进化）稳定性，以及与突出序列的同源性，最好是BLAST控制。
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随后，可以使用特定的（免费）（基于网络的）软件工具选择引物。更复杂的软件工具可在市场上买到，一般来说，不基于网络。
引物设计标准
独特的引物需要根据一些标准来设计，这些标准涉及引物的统一性、杂交条件下的线性、与目标物杂交时的稳定性、减少合成非特异性产物的变化等。许多这些标准被纳入独立的或在线的软件中；当引物不理想时给予惩罚，或对最佳引物给予高分。在此，以下要求是非常重要的：
引物内没有碱基配对（引物在杂交过程中是「开放卷曲」的）。
没有GC-,GG-或CC-重复。
应避免有超过3个相同碱基的重复（同聚物运行）。
syn与3′端部的目标完美匹配。
内蒙古工业大学跳楼一个最佳的引物序列包含分布良好的核苷酸；即在位置和类型上都是如此。
应防止正向引物和反向引物之间因互补碱基而杂交形成双联，特别是不应该有3′互补（图3a）。DNA聚合酶将产生引物二聚体，也被称为自体二聚体或交叉二聚体，从两个引物甚至小的双联区的3′-OH末端开始。即使没有3′-互补性，在反应物的不利比例下，如没有目标，也可能形成二聚体（图3b）。由于引物内其他核苷酸位置的互补性，引物之间的碱基配对也必须避免，因为这也可能导致引物二聚体的尺寸较小，熔化温度较低。虽然引物二聚体很容易被识别，但特异性扩增的效率会降低。
Tm值需要相似；最好在60℃左右，不低于56℃。
引物的GC含量最好保持在45%以下，但应与完整的目标序列保持一致。
优选的是，引物序列由分布广泛的核苷酸组成，并避免同聚物的运行。
目标的引物退火位点必须是可接触的，最好不要位于稳定的发夹内。
引物序列的理想长度为18-25个核苷酸，与所需的Tm和特异性有关。当使用LNA核苷酸或MGB时，要求的长度可能短至12个核苷酸。
对于某些DNA，有可能设计出与两个连续外显子退火的引物，以防止与含有内含子序列的基因组DNA杂交。在这种策略中，基于内含子序列的引物设计是检测基因组目标的一种选择。然而，对假基因的鉴别是不可能的。由于许多细菌和线粒体DNA缺乏内含子，因此不可能设计出跨越内含子的引物。
一对引物必须对其互补的目标序列有相当的亲和力（即Tm）。这将促进聚合过程中生长的新DNA链的稳定性。
当测试样品含有目标DNA时，设计的引物需要产生正确长度的扩增物，而在非目标DNA样品中，不应该形成扩增物。
探针检测中使用的引物对的Tm需要与探针的Tm一致，例如水解探针要低5-10℃（见第3.6.1节）。
离子强度（Na+；Mg2+）、缓冲液（容量）、寡聚物的浓度以及如果有的话，PCR混合物中的DMSO必须作为新引物设计的参数。
透明国际组织如果在某些位置可能出现错配，可以将错配容忍度作为引物设计的标准。
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