2020年12月Dec.2020
第40卷第12期Vol.40,No.12
热带农业科学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
胡文斌1)②
林家年2)洪青梅1)李婧1)濮文辉1)
何
云1)
李洪立1)③
李
琼1)③
海南海口571101;
2海南大学热带农林学院
海南海口570228)
摘
要
为了筛选出适合火龙果种质资源遗传多样性分析和品种鉴定的SSR 核心引物，以遗传背景差异较大的8 份火龙果种质资源对已报道的20对火龙果SSR 引物和本课题组转录组测序开发的100对EST-SSR 引物进行初步筛选，筛选出引物36对。再利用18份形态差异较大、不同来源的火龙果种质资源对初筛引物进行复筛和验证，筛选出24对SSR 核心引物，并通过遗传多样性分析和聚类分析验证引物的有效性。
24对核心引物对18份火龙果种质资源进行遗传多样性分析，共得到117个等位基因，平均每个位点等位基因数（Na ）4.88个，有效等位基因数（Ne ）为2.341，期望杂合度（He ）为0.516，多态性信息含量指数（PIC ）平均为0.471，说明引物的多态性较高，能够有效揭示18份火龙果种质资源的遗传多样性。筛选出的24对SSR 引物，带型清晰、稳定，多态性较高，可作为核心引物用于现有的火龙果种质资源鉴定和遗传多样性分析等研究。关键词
火龙果；SSR 核心引物；遗传多样性；聚类分析；品种鉴定
中图分类号
S628；S667.9
文献标识码
A
DOI ：10.12008/j.issn.1009-2196.2020.12.007
Screening of SSR Core Primers for Pitaya
HU Wenbin 1)
LIN Jianian 2)
HONG Qingmei 1)LI Jing 1)
PU Wenhui 1)
HE Yun 1)
LI Hongli 1)
LI Qiong 1)
(1Tropical Crops Genetic Resources Institute,CATAS,Haikou,Hainan 571101,China;
2Institute of Tropical Agriculture and Forestry,Hainan University,Haikou,Hainan 570228,China)Abstract In order to screen out suitable SSR core primers which can accurately evaluate pitaya germplasm resources genetic diversity and identify pitaya cultivars,based on the 8pitaya germplasm resources with distant genetic relationship,20pairs of SSR primers from the articles and 100pairs of SSR primers developed from pitaya transcriptome were initially screened out,there were 36pairs of primers were screened out.Then 18pitaya germplasm resources with differ
ent geographical origins and morphological characteristics were chosen to screen the initial selected primers.Finally,a total of 24pairs of SSR core primers were identified.The genetic diversity of 18pitaya germplasm resources was analyzed by these core markers.As a result,117polymorphism bands were acquired.The average number of alleles (Na ),effective alleles (Ne ),and expected heterozygosity (He )are 4.88,2.341and 0.516respectively.The average PIC (Polymorphism information content)value is 0.471.The results showed that SSR primers with high polymorphism can evaluate the genetic diversity of the 18pitaya materials effectively,the 24core primers can produce clear amplification results with good repeatability and high polymorphism,and can be applied to pitaya germplasm resources identification and genetic diversity analysis.
Keywords pitaya ;SSR core marker ;genetic diversity ;cluster analysis ;cultivar identification
①基金项目：海南省自然科学基金青年基金项目“火龙果种质资源遗传多样性与分子身份证研究”（No.318QN263）；中国热带农业科学院基本科研业务费“火龙果种质资源评价与创新利用研究”（No.1630032018035）。收稿日期：2020-06-30；编辑部E-mail ：；责任编辑：曾莉娟；排版：曾莉娟。②胡文斌（1986～），男，助理研究员，硕士，研究方向为种质资源学，邮箱。③通讯作者：李洪立（1975～），男，副研究员，学士，研究方向为种质资源学，邮箱；李琼（1972～），女，研究员，硕士，研究方向为种质资源学，邮箱。
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热带农业科学
火龙果（Hylocereus undatus Britt.&Rose）又名红龙果、青龙果等，属仙人掌科（Cactaceae）多年生攀缘植物，是一种原产于墨西哥南部及中美洲诸国的太平洋沿岸地区的热带果树。也是近年在热带亚热带地区国家发展起来的具有较高的营养价值［1］、药用价值［2-4］以及观赏价值［5］的新兴热带亚热带果树。优异亲本资源的筛选和种质资源的准确鉴定是品种选育和推广的必要基础。由于中国不是火龙果的原产国，火龙果种质资源不够丰富，遗传基础狭窄，新品种选育落后于其他国家，加上现有主栽品种同质化较严重，且存在严重的同物异名、同名异物以及品种混淆等问题。为了实现种质资源的科学管理和有效利用，亟需开展现有资源的准确鉴定和遗传多样性分析。但是由于火龙果叶已经高度退化成刺，许多种类外形特征极为相似，传统分类学手段难以有效鉴定，给种质准确鉴定造成了困难，使得火龙果的分类和系统发育关系非常混乱，物种界定不够明确［6］。
利用分子标记开展种质资源遗传多样性、亲缘关系分析、种质资源鉴定等已经在许多重要作物上广泛
应用［7-8］，近年来利用RAPD、ISSR、SRAP 等分子标记技术对火龙果种质资源进行研究有一些报道，如TEL-ZUR等［9］采用RAPD分子标记技术分析了量天尺属与蛇鞭柱属火龙果的遗传关系；TAO J等［10］利用ISSR引物成功构建50个火龙果种质指纹图谱；张冰雪等［11］利用ISSR分子标记对贵州省火龙果种质进行遗传多样性和亲缘关系的分析；王彬等［12］采用ISSR分子标记技术对紫红龙火龙果及其大果型芽变系进行了遗传鉴定；袁亚芳等［13］也通过ISSR分子标记方法检测了福建省的20份火龙果种质资源多样性。我们课题组前期亦通过SRAP分子标记开展32份火龙果种质资源遗传多样性分析［14］。但是这些研究都是使用通用引物分子标记法进行品种多样性分析和鉴定，重复性准确性较低。
微卫星DNA标记（Simple Sequence Repeat，SSR）具有多态性高、稳定性强和共显性遗传等优点，已在水稻、大豆、玉米等作物研究中广泛应用，已经成为研究遗传多样性和指纹图谱等首选标记，非常适合亲缘关系较近物种和种内资源的分子身份证建立［15］。SSR在鉴定杂交以及多倍体的来源方面也有比其它分子标记具有更为重要的优势［16］。Limei Pan［17］等在国内最早利用SSR标记开展了46份火龙果种质资源遗传多样性分析；杨仕美［18］等利用SSR标记完成了38份火龙果种质资源亲缘关系分析。这些研究为本试验开展打下了一定基础，但是其所用材料、SSR引物有限。为了筛选出适合现有火龙果种质资源遗传多样性分析和品种鉴定的SSR核心引物，本试验利用来源于不同系统、遗传背景差异较大的21份火龙果种质资源对已报道［17］的20对火龙果SSR引物和本课题组转录
组测序开发的100对EST-SSR引物进行筛选，筛选出适合火龙果种质资源遗传多样性分析和品种鉴定的SSR核心引物。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1火龙果材料
供试21份火龙果种质资源（表1）主要来自火龙果主产区，包括国内的海南、云南、广西、广东、福建等地省份，以及国外的以列、厄瓜多尔、美国、越南等国家。以上材料均保存于海南儋州中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业农村部火龙果种质资源保护海南创新基地。
1.2方法
1.2.1DNA提取
使用天根生化科技（北京）有限公司高效植物基因组DNA提取试剂盒，提取21份火龙果有嫩茎样品的总DNA，操作参照产品说明书进行。样品统一稀释到50ng/μL后，-20℃保存备用。
1.2.2SSR引物合成
引物筛选所用的120对引物来源于已报道的20对火龙果的SSR引物［17］和笔者课题组转录组测序开发的100对SSR引物。普通引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成，毛细管电泳所需荧光引物由武汉诚至生物科技有限公司合成。
1.2.3核心引物的初步筛选
利用遗传背景差异较大的8份火龙果种质资源
--36
胡文斌等火龙果SSR分子标记核心引物的筛选
对已报道的20对火龙果SSR引物和本课题组火龙果转录组测序开发的100对EST-SSR引物进行初步筛选，以稳定性好、条带清晰、易于统计、多态性信息量（PIC）较高为标准，初步确定核心引物。
PCR反应体系总体积为20μL，含2×Taq PCR Master Mix10.0μL，F-primer（10μmol/μL）和R-primer（10μmol/μL）各0.8μL，模板DNA （50ng/μL）1μL，ddH2O7.4μL。所用试剂均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。
PCR反应优化程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度下退火30s（根据引物Tm 值设计
退火温度），72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR扩增在德国Bio‐metra TGRADIENT型PCR扩增仪上进行。引物初筛使用4%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳后用BIO-RAD ChemiDoc XRS+成像系统观测结果，拍照保存。统计数据，以稳定性好、条带清晰、易于统计、多态性较高为标准，初步确定核心引物。
1.2.4核心引物的复筛和验证
利用18份形态差异较大、不同来源的火龙果种质资源对初筛引物进行复筛和验证，使用毛细管电泳检测，每对引物的正向引物（F引物）均加了通用M13接头序列TGTAAAACGACGGCCAGT。另外合成加FAM荧光基团的M13荧光接头引物。SSR荧光引物反应体系（共10μL）：PCR反应体系总体积为
表121份火龙果种质名称、来源和主要特征
编号1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 14 15 16
17 18 19 20 21种质
编号
x4
045
368
H1
H2
H3
H4
H5木质素
H6
H7
H8
09
H10
H11
H12
H13
H14
H15
H16
H17
H18
种质名称
‘仙人掌'
‘白水晶'
‘双'
‘无刺红肉'
‘白水晶2'
‘无刺黄龙'
‘双球'
‘大红'
‘软枝大红'
‘蜜宝'
‘白玉龙'
‘横县一号'
‘越南白肉'
‘越南红肉'
‘玫瑰一号'
‘巨红2号'
‘黑龙'
双氧水稳定剂‘蛇鞭柱2'
‘燕窝果'
‘EL'
‘柠檬'
来源
海南儋州
广东从化
广西百
海南琼海
广西南宁
以列
海南琼海
海南东方
广西南宁
海南东方
海南琼海
广西横县
越南
广西南宁
广西南宁
广西南宁
广东湛江
福建福州
厄瓜多尔
美国
云南景洪
属
Opuntia
Hylocereus
Hylocereus
Hylocereus
Hylocereus
Hylocereus
Hylocereus
Hylocereus
Hylocereus
Hylocereus
Hylocereus
Hylocereus
线速度Hylocereus
Hylocereus
Hylocereus
Hylocereus
Selenicereus
Selenicereus
Selenicereus
Hylocereus
Hylocereus
Hylocereus
主要特征
扁平状
3～5棱，棱边缘无木栓化，波浪形，红皮白肉，果基部带刺
3棱，棱边缘木栓化，，波浪形，红皮双，果无刺
3棱，刺少而短，棱边缘木栓化，平滑形，红皮紫肉，果无刺
3～5棱，棱边缘无木栓化，波浪形，红皮白肉，果基部带刺
3棱，刺少而短，棱边缘木栓化，波浪形，黄皮白肉，果无刺
3棱，棱边缘木栓化，波浪形，红皮双，果无刺
3棱，棱边缘部分木栓化，波浪形，红皮红肉，果无刺
3棱，棱边缘部分木栓化，波浪形，红皮红肉，果无刺
3棱，棱边缘部分木栓化，波浪形，红皮红肉，果无刺
3棱，棱边缘木栓化，波浪形，红皮白肉，果无刺
3棱，棱边缘木栓化，波浪形，红皮白肉，果无刺平缓
3棱，棱边缘木栓化，波浪形，红皮白肉，果无刺
3棱，棱边缘无木栓化，锯齿形，枝条带粉状物，红皮紫肉，
果无刺
3棱，棱边缘无木栓化，锯齿形，枝条带粉状物，红皮紫肉，
果无刺
3棱，棱边缘无木栓化，锯齿形，枝条带粉状物，红皮紫肉，
果无刺
3棱且近圆柱形，平滑形，褐红皮红肉，果带刺
2棱，棱边缘无木栓化，圆锯齿形，刺少且极短
3棱，棱边缘无木栓化，平滑形，黄皮白肉，果带刺
3棱，棱边缘木栓化，波浪形，枝条带粉状物，暗红皮紫肉，
果无刺
3棱，棱边缘无木栓化，锯齿形，枝条带粉状物，红皮紫肉，
果无刺
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热带农业科学
10μL，含2×Taq PCR Master Mix 5.0μL，F-primer（10μmol·L-1）0.1μL，带荧光的M13F-primer（10μmol/μL）0.4μL，R-primer（10μmol/μL）0.5μL，模板DNA（50ng/μL）0.5μL，ddH2O 3.5μL。
扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，复性30s（根据引物Tm值设计退火温度），72℃延伸30s，共35个循环；最终72℃延伸10min。4℃保存。
将甲酰胺与分子量内标按100︰1的体积比混匀，再将PCR产物进行稀释10倍后，取1μL PCR稀释产物＋9μL甲酰胺（含1%分子量内标）变性后上DNA测序分析仪ABI3730xl进行毛细管荧光电泳检测。
1.2.5数据处理与统计分析
将毛细管电泳检测结果导入到Gene Marker分析软件中，进行数据整理，每对引物导出PDF峰图文件。根据毛细管电泳结果，选择条带清晰、多态性高的进行统计，将同一位点的所有等位基因从小到大排列，有条带记为“1”，空白记为“0”，统计所得的数据利用Excel软件转换成NTSYS-2.10所需要的格式，利用软件NTSYSpc2.10，采用非加权组平均法（UPGMA），利用筛选出的SSR核心引物对18份火龙果种质资源进行聚类分析，验证核心引物的有效性。用GenAIex和Cervus软件进行遗传多样性分析，等位基因数Na、有效等位基因数Ne、香农信息指数I、观测杂合度Ho、期望杂合度He等参数使用GenAIex软件计算，各个位点的多态性信息含量（Polymorphism information con‐tent，PIC值）由Cervus软件计算。
2结果与分析
2.1SSR核心引物的筛选
用遗传背景差异较大的8份火龙果种质资源对120对EST-SSR引物进行引物初步筛选。经两轮筛选后，选出具有明显多态性且带型稳定引物36对。再利用18份形态差异较大、不同来源、在现有种质中具有代表性的多种类型的火龙果种质资源对初筛引物进行复筛和验证，最终筛选出24对SSR 核心引物（表2）。
表2核心引物在参试种质中的多态性信息
HU-ssr3 HU-ssr10 HU-ssr11 HU-ssr15 HU-ssr19 HU-ssr20 HU-ssr23 HU-ssr27 HU-ssr35 HU-ssr36F：GACGTGCAGTGACAGATTTACAG
R：ATCTCCTTCCTCAGTCTAGGGC
F：CAACCTTTCTCCCTCTCTCTCAG
R：ACTGTTCGGGTTCTGGGTTAG
F：GGTCGAGCTTCATCTTTTGTTC
R：AAAGGAGACAGAGATAATTCGTGC
四象限探测器
F：AACAACAGTACCTTAGGGTCACATC
R：AGTGTGTCCTCCCAAAGTAACAG
F：CTTGTGCTCTACAGCTTGATCCT
R：CTCTGTTCGTTTTCGGGTTTT
F：ACTACGAGGAGGAGAGTGACCC
R：GAGAGAAGATGGGAATGGAAGTC
F：ATGAACCACCTACGGCAGAC
R：CAAGCATTTCCGTCTCCATT
F：TCTCGGAGGCATCAAAGAGT
R：TCCTCCATAAACCAAGGGTG
F：CCAATAACCACATGTGCAGG
R：TGTGGAAGGAACGAGAAAGG
F：TGACCAGCTGCCCTTAGTTT
R：CCCACCAAAATCACCATAGG
7
4
4
4
8
3
6
3
3
3
2.115
2.445
3.467
2.196
5.582
1.120
2.116
1.982
1.781
2.052
1.168
1.021
1.307
1.036
1.847
0.255
1.128
0.769
0.778
0.829
0.389
0.889
0.889
0.556
0.778
0.056
0.556
0.278
0.000
0.000
0.527
0.591
0.712
0.545
0.821
0.107
0.527
0.496
0.439
0.513
0.502
0.509
0.659
0.505
0.797
0.105
0.502
0.397
0.396
0.427
引物名称引物序列
等位
基因数
有效等位
基因数
香农信息
指数
观测
杂合度
期望
杂合度
多态信息
含量指数
--38
胡文斌等火龙果SSR分子标记核心引物的筛选
HU-ssr43 HU-ssr44 HU-ssr56 HU-ssr65 HU-ssr66 HU-ssr67 HU-ssr74 HU-ssr77 HU-ssr80 HU-ssr85 HU-ssr86 HU-ssr91 HU-SSR94 HU-ssr99平均值F：GGGCGATATCATCTTTCCTG
R：GAGTCTGCTTCGGAGTCGTT
F：CAGTAGCAACTGCGGTCAGA
R：TAGTGGTCCGGTAAAGTGCC
F：AAGCTATTCCTCGCGACTCA
R：GGCTACCTTTCCGACTCACA
F：AATTTTGCCATCAGAGAGGC
R：TGGAAGCATCCACATAAAACA
F：CTGTAACATCCCAGCCACCT
R：GGGGCTGTATGCCTGTATGT
F：TACCATGTTTGGTTGCTTGC
R：TGTGCGTAGAAAGCGAGAGA
F：GCAAAAGAAGATATAAACAGCAGAAA
R：TGCAAGAAGGTTTGTAGGGG
F：CGATGTTCCATCTTCGCTTT
R：GCCAATTCTGAGAGGCAGTC
F：AATGGCTCGGTAAAATCACG
R：GTATTCCTGGGTGGTTGTGG
明史张溥传F：CCCATGCTAATTGCTTACCC
R：GCAGTTGTGGATGCTTTTCA
F：AAATCACAAGGGCAATGAGG
R：AAGAAGACCGAGGCACAAGA
F：ATGGAGTTGGGACTCTCGAA
R：CACAGCAACCAGAACGAAGA
F：AGGAAACAAAGCCAAGCTCA
R：CGATGTCCCCATTTGAGAAT
F：CTAGCGCGTGGATAGAAAGG
R：GAACTTCATTGGGCGTAGGA
6
2
4
5
2
8
5
3
5
5
4
10
6
7
4.88
2.589
1.975
2.048
1.425
1.994
2.464
3.236
1.274
2.339
2.440
1.419
4.104
1.732
2.297
2.341
1.217
0.687
0.974
0.675
0.692
1.344
1.276
0.445
1.151
1.112
0.620
1.825
0.945
1.260
1.015
0.500
0.222
0.111
0.111
0.167
0.389
0.167
0.000
0.529
0.222
0.111
0.500
0.389
0.333
0.339
0.614
0.494
0.512
0.298
0.498
0.594
0.691
0.215
0.572
0.590
0.295
支护
0.756
0.423
0.565
0.516
0.564
0.372
0.472
0.287
0.374
0.569
0.631
0.204
0.536
0.527
0.280
0.736
0.406
0.542
0.471
续表2核心引物在参试种质中的多态性信息
引物名称引物序列
等位
基因数
有效等位
基因数
香农信息
指数
观测
杂合度
期望
杂合度
多态信息
含量指数
2.2核心引物的多态性信息
24对SSR核心引物在18份火龙果种质资源中共检测出117个等位变异，变化范围2～10，平均每个位点等位基因数（Na）4.88个，有效等位基因数（Ne）变化范围1.120～5.582，平均2.341，香农信息指数1.015，观测杂合度（Ho）0.339，期望杂合度（He）0.107～0.821，平均0.516，多态性信息含量指数（PIC）0.105～0.797，平均0.471，说明引物的多态性较高，引物总体上鉴别能力尚可，能够有效揭示18份火龙果种质资源的遗传多样性，也能用于种质资源指纹图谱（表2）构建其中引物HU-ssr19、HU-ssr91的PIC值高，表明其有极高的鉴别能力，可以将绝大多数材料鉴别出来。筛选出的24对SSR引物，带型清晰、稳定，多态性较高，可作为核心引物用于现有的火龙果种质资源鉴定和遗传多样性分析等研究。2.3供试材料聚类分析
根据24对核心引物扩增数据，利用NTSYS-pc 2.1软件，依据遗传相似系数采用UPGMA算法对18个火龙果种质进行聚类分析，见图1。结果表明，在遗传相似系数为0.68时，18份供试材料总体上被分为3个类。其中第一类只包含了H15（‘蛇鞭柱2’），其在表型上完全区别于其他类型的观赏型蛇鞭柱属植物，单独成一类。第二类包括H14、H16、H17，主要为来自蛇鞭柱属的H14（‘黑龙’）、H16（‘燕窝果’），来自量天尺属的H17（‘El’）。第三类为量天尺属类或杂交体，总共有14份，包括H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、
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