19种PCR检测新技术的介绍
热启动PCR
1.概述：尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。热启动就是PCR仪达到变性温度再加入Taq DNA聚合酶，从而抑制一种基本成分延迟DNA合成。 汉字到底有多形象2.应用：如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作
4.优缺点：⑴优点：提高PCR特异性最重要。⑵缺点：方法十分烦琐，尤其是高通量应用。
Touch-down PCR
1. 定义：又称降落PCR.即选定一个温度范围，如50-35℃，每降1-2 ℃进行1-2个循环，然后在50度下进行15个循环。
西江月夜行黄沙道中翻译2.原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。 3.选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的Tm值高出5-10度，然后每个循环递减1-2度。
4.应用范围：
⑴low copy of targeted DNA; ⑵ RT-PCR using oligo-dT;
⑶ high degree degeneracy (or less specific) of the first set of primers.
RT-PCR
1.定义：是以RNA为模板，联合逆转录反应（reverse transcription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA 模板。 RNA扩增包括两个步骤：在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA；加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA。
2.检测方法
⑴一步法：利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP 直接进行mRNA反转录与PCR扩增。Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检 测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA.该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。
⑵两步法：由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量PCR.两步法则是将RT和PCR分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的RT-PCR。
兼并引物PCR
纽虫
1.概述：兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，产物特异性越强。
2.设计引物原则：尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR；次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。
巢氏PCR（Nested PCR）
1.定义：也称套式PCR是指利用两套PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。在这种技术中，首先用一对外引物进行第1轮PCR，然后再使用第1对引物扩增的DNA 序列内部的一对引物再次扩增。
2.优点：由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。在一定情况下，这种方法对减少PCR后扩增产物的污染问题极为有用，但它增加了每次试验的复杂性。
太原战役3.应用范围：一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
反向PCR（Inverse PCR）
1.概述：反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.
2.反向PCR的操作流程：扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。
3.选择多种限制性内切酶的基本准则：是选择不能在非酶切位点切断靶DNA的酶。裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或下游区，而不裂解核心区的酶则使两侧序列都扩增。Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。
不对称PCR
1.概述：不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50——100:1。在PCR反应的最初10——15个循环中，其 扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR 就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双键 DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA。不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定。
原位PCR
1.概述：原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。原位PCR是Hasse等于1990年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等.
2.其基本方法为
①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶. ②蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶K.③PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR 的装置.④杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交.⑤显微镜观察结果.
重组PCR
1.定义：使两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR(recombinant PCR)。Mullis等于1986年报道了由PCR扩增的两个DNA片段通过重组合后再经延伸而制备出新的DNA分子。
2. 其基本原理：将突变碱基，插入或缺失片段，或一种物质的几个基因片段均设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。其产物将是一重组合的DNA。
附庸3.应用范围：主要用于位点专一碱基置换，DNA片段的插入或缺失DNA片段的连接(如基因工程抗体)。
多重PCR
1.概述：多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
2.特点:
①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检。③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。
3.用途主要有两方面:
⑴多种病原微生物的同时检测或鉴定：①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染。②肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和，同存一病人并同时发病。③性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断。④战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，杆菌，鼠疫杆菌等侦检。⑤需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等。
⑵病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。
免疫-PCR(immuno-PCR)
1.定义：免疫-PCR(immuno-PCR) 它利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测。是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统。主要步骤有三个:①抗原-抗体反应，②与嵌合连接分子结合，③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA(一般为质粒DNA)。
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