5 Race
(2007-11-18 21:37:08)
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如果您顺的话，一个礼拜足矣！
同意，5'-RACE确实比较难，但也有顺利的时候，我上周做5'-RACE也一次就成功了，我觉得关键还是RNA 的质量，如果RNA模板质量不好，后面做得再认真也是白费！
当时要克隆基因的5'GC翼首草含量达到了80%，一般的反转录酶和PCR都拿不到，后来加了海藻糖60度反转录一个小时后，用TaKaRa的GC-Buffer和LA-Taq才扩出来，当时就为了这个5端，很是费了力气。
如果RCR产物不是很特异或没有目的条带的话，建议用nest PCR。在做5‘时，对RNA要求比较高，最好用新鲜的组织提，随即做逆转录，扩增。做RACE PCR条带单一的不多，尽可能的回收与目的片段大小相近的条带。克隆的时候，一般kit上建议挑8-10个克隆，多一个，多一份希望，因为RACE，尤其是5’太难了，我作了约6个月。 偶没有买试剂盒，自己合成了3条引物，买了反转录酶。然后一次就出来了。 RACE的盒子最常用的是CLONTECH和INVITROGEN的，
这个方法我也试过很多次了，方法很简单，但是作出来效果非常的不理想。
PCR出来的东西都是杂七杂八的东西，更多的时候是弥散的条带。
SmartRace 既然称之为Smart，因为它的引物能特异的识别5'端帽子位点，因此排除了所有非完全的逆转录。再加上使用基因特异性引物，使其做出来的可能性更大。
这个方法省钱，但是我不是很看好，祝好运。
另，建议你不要用oligodT进行逆转录，在基因mRNA300bp处设计一条或几条基因特异性
逆转录引物更好。
希望你能有好结果。
我刚做过5’、3‘ RACE，我个人的经验如下：
1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；
2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区；
3、用巢氏PCR相对容易出结果；
4、如果出现多个条带，要分别验证；
5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min；
6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。
这里有两个原因：
1、Tm大于70度，好做touchdown PCR；
2、相应加长引物，可以更有效地扩增，尤其是针对丰度低、比较难扩的产物。
RACE是采用PCR技术由已知的部分cDNA顺序来扩增出完整的cDNA 3 '和5 '端的方法，又被称为单边PCR(one-sided PCR)和锚定PCR(anchored PCR)。
3'-RA CE的—般过程是：以oligo(dT)17和在许多文章中被称为锚引物(anchor primer)或接头(adaptor)的序列组成的引物QT逆转录mRNA得到第一条cDNA链，然后用含部分锚引物序列的引物Q0与基因特异性引物GSP1进行第一轮扩增得到双链cDNA ，第二轮扩增则采用内部引物(nested primer)Ql和GSP2，以防止产生非特异性扩增产物。
采用同样的原理可以进行5'-RACE,
先用基因特异性引物GSP-RT逆转录mRNA 获得cDNA第一条链I
然后用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和dATP在cDNA 5 '端加上poly(A)尾巴再使用
(1)QT引物合成cDNA第二条链；
(2)Qo和一个在GSP-RT上游的引物GSP1扩增cDNA,最后采用内部引物Q1和GSP2进行第二轮大茴香脑
PCR扩增以提高特异性。扩增后得到的双链cDNA用限制性内切酶酶切和Southern杂交分析并克隆，得到5'特异性和3’特异性的cDNA文库。从两个有相互重叠顺序的5'和3' RACE产物中可以获得全长cDNA，或者可以分析5 '和3 '端顺序，合成相应引物扩增出全长cDNA 。 目前,对于扩增基因的5'端还没有一种完美的技术,RACE 也不例外,特别是5'RACE 对于得到的克隆(经检测后为阳性克隆),通用的做法是挑选10个以上的单克隆送去测序.就我个人经验,也是挑了5个才测到我的目的基因的.
建议你用clontech 的smart race试剂盒,我以前用的也是TAKARA的,结果做了N 次都没出来,换试剂盒后一次就做出来了.
合成单链CDNA后,用TAQ酶来合成第二条链,也就是相当于双链DNA中的另一条链,用的是上游引物,按照碱基互补的原理,在酶的作用下完成.
我刚刚做过RACE，其实当时本来买试剂盒准备建cDNA文库的，但是库建的不好，杂交了好几次都没杂出东西来，后来用它的接头引物和基因特异性引物扩增，最初只设计了特异性引物的巢式引物，最初扩不出东西来，后来把接头引物也设计了内部引物，而且pcr时把模板的量加大，因为可能模板少也很难扩出来，我们都用该方法扩的，都出来了，当然有时有多条带需验证是否单引物扩增产物。这是我做实验的体会，祝大家早日出结果。
SMARTTM 5‘-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3' / 5‘-
RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3‘和5‘端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。
我们在实验中发现，要做好RACE反应实验不容易，实际操作中仍存在不少困难。因此，对RACE反应条件进行反复摸索是实验必须要做地。这是因为:第一，在5‘-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤(反转录、同聚物加尾和PC R扩增)，每一步都可能导致失败;第二，扩增。DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品不均一性，因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用RACE技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除RACE实验结果中扩增产物假阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。我们相信，温州民房倒塌
第一链，同时利用它的加尾特性在合成的cDNA链3’加上3-4个dCTP，而且当帽子结构存在时该酶的加尾活性最高（对全长分子的富集机制），随后这3-4个碱基与体系中事先加入的引物（该引物的3’端有3-4个dGTP）配对，MMLV继而以聚合酶活性将配对引物补成双链。目前基于该技术的试剂盒只有Clontech公司生产，全名为SMART RACE cDNA amplification kit（Cat634914）流程见图：
乳糜血该方法的突出优点就是操作简便，成功率较高，全场分子的比例较高。cDNA第一链的合成和加尾一步即完成，避免了其他方法中对mRNA和cDNA链的反复操作，降低了mRNA降解和合成产物丢失的风险，使本来就含量甚微的全长分子得到最大保存，所以这种方法得到了广泛认可，应用最多。如果加上RNA提取时间，这种技术可以在3个小时内得到加上接头的cDNA产物，最大限度地降低了mRNA的降解风险。
2、Oligo capping method方法（又称中国校园网RLM-RACE）是由日本东京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。我们知道真核生物的mRNA具有一个3’尾巴和一个5’帽子结构，该技术正是利用5’端的帽子特性对全长分子进行富集和扩增。降解的mRNA5’端都有一个磷酸基，用碱性磷酸酶去掉该磷酸基，随后用烟草酸性焦磷酸酶去掉帽子结构，则全长分子的5’端会暴露出磷酸基，随后的连接步骤中锚定引物将特意的加在全长分子的5’端而不会和降解的分子连接（全长分子的富集机制）。目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5’-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）两家都有生产，步骤如图：
该方法的最大优点就是全长分子的比率高，可以说只要是扩增产物就肯定是全长分子。但
是该方法的最大缺点是操作复杂，而且都是针对mRNA分子进行操作，使mRNA分子降解的风险极大提高，所以成功率不是很高。对于新手和实验室条件较差者不推荐使用该试剂盒。
3、Self-ligation技术。基因特异性（或者OligodT）反转录合成cDNA第一链，RNase H降解杂合链中的RNA，连接酶连接纯化后的cDNA链，在已知片段上设计反向PCR引物进行未知片段的扩增。该试剂盒宝生物以前有售，现在已停产，原理如图：
该试剂盒想法十分好，但是由于没有全长分子的富集机制，得到全长分子的几率比较低。而且在实际使用中它的扩增片段都比较短，不能满足实验要求。
4、Anchored PCR方法。利用一条基因特异性反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链，将RNA-DNA杂合链中的RNA降解纯化后，利用末端转移酶在cDNA链的3’端加入PolyC尾巴（尾巴长度不能确定），然后利用abridged anchored primer和一条基因特异性引物扩增（可能需要巢式PCR才能得到结果）。该试剂盒有Clontech（Marathon cDNA amplification, Cat: 634913）和Invitrogen（5’RACE system for rapid amplification of cDNA ends, Cat: 18374-058）公司在售，操作简图如下：
该法最大的缺点是全长分子的比率较低，而且操作复杂，整个实验流程需要耗费超过一天的时间。这种方法没有像SMART和Oligo capping method中那样采取对完整分子的富集机制，所以它依赖于高质量的反转录酶（具有通读复杂二级结构的能力、具有较高的反应温度）和高质量的RNA，否则得到全长分子的几率会很低。
你这个就是利用的invitrogen的5‘RACE试剂盒的原理啊。自己只需要买TdT和
dCTP就行了，既方便又省钱，我们实验室就是这样做的。RT产物的纯化只需要用普通的胶回收试剂盒就行了，我们实验室用的是Omega的。至于第二点的话当然可行啊，你有什么顾虑呢？
呵呵，300bp应该不难。
建议你，做每一步时都有个证明每个步骤是否出错得对照。
秦皇岛教育学院模版的质量应该要高。
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