陈映真作者：⼦⾮鱼
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提及PCR，这可是实验室⾥的⽼朋友了。作为科研升级打怪之路上的第⼀道最基本关卡，初踏进科研界的实验狗们，⼜有哪个没有与之打过交道？可饶是如此，不少菜鸟在闯关时仍会被摔的⿐青脸肿，原因⽆他，引物设计不好之过矣。
显然，欲过此关，则必先通过引物设计的试炼。好在⽹上流传着各类PCR引物设计软件，各显神通后可快速为⼤家设计出最佳引物，以助⼤家⼀臂之⼒。⽽本⽂也搜集⼀箩筐各具特点的引物设计软件，⼤家按⾃⼰的需要进⾏选择即可。
经典款
1.Primer Premier
Premier是由加拿⼤的Premier公司开发的专业⽤于PCR或测序引物以及杂交探针的设计和评估的软件，应该是使⽤范围最⼴的⼀款软件了。主要界⾯有序列编辑窗⼝（Genetank），引物设计窗⼝（Primer Design），酶切分析窗⼝（Restriction Sites）和 Motif 分析窗⼝。 Primer Premier软件的主要功能分四种，即引物设计、限制性内切酶位点分析、DNA 基元(motif)查和同源性分析功能。前三种为其主要功能。
此外，该软件还有⼀些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列"朗读"、DNA 与蛋⽩序列的互换、语⾳提⽰键盘输⼊等等。（⽂章链接：PrimerPremier 6安装、破解、引物设计实操攻略）
2.Oligo7
该软件主要应⽤于核酸序列引物分析设计，同时计算核酸序列的杂交温度（Tm）和理论预测序列。作为⽬前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，其主要功能包括：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。它的引物分析功能如此强⼤以⾄于能风靡全世界。（⽂章链接：⼲货 | Oligo设计引物，就是这么简单）
3.Beacon Designer
Beacon Designer是⼀款功能强⼤且简单易⽤的Real-time PCR引物设计的必备武器。它可在⽬的基因的任意位置中定位引物，⽐如跨内显⼦-内显⼦或外显⼦-外显⼦设计引物，适⽤于SYBRGreen试验设计。此外，它可⽤于HRMA试验设计、双标签探针设计（如TaqMan® 探针、分⼦信标、Scorpions引物和探针、FRET探针）。 在线款
1.NCBI的Primer-Blast
通常⽤另⼀个站点或⼯具设计好引物后，还得⽤BLAST进⾏引物特异性验证。但这个⼯具整合了⽬前流⾏的Primer3软件，同时也能通过NCBI的Blast进⾏引物特异性的验证，⽐较快捷⽅便。
且该⼯具还可针对某⼀特定剪接变异体基因来设计引物——这是⽤来衡量基因在特定组织中特异性表达的重要特征。此外，Primer-BLAST有许多改进的功能，⽐单个的⽤Primer3和NCBI BLAST更加准确。
Primer-Blast的界⾯包括4个部分：PCRTemplate（模板区），Primer Parameters（引物
区），Exon/intronSelection（外显⼦内含⼦设置）和specificity check（特异性验证区）。
2.Primer3 Plus
Primer3是⼀个⾮常简单却⾼效的引物设计在线软件。你只需在⽬标序列中粘贴DNA序列后点击搜索即可。其中，可通过多种⽅式来对结果进⾏筛选，包括PCR产物的⼤⼩、引物⼤⼩、Tm范围和其他参数。同样，还可使⽤Primer3来设计
北京ons
过多种⽅式来对结果进⾏筛选，包括PCR产物的⼤⼩、引物⼤⼩、Tm范围和其他参数。同样，还可使⽤Primer3来设计⽤于PCR-ELISA的杂交探针和其他基于探针的PCR引物设计。
另外，严格的qPCR引物设计⼀般要求其中⼀条引物要跨外显⼦，最好在3‘端设计引物，产物的长度在300bp以内等。本在线软件可满⾜qPCR引物设计的要求。
3.BathPrimer3.0doaj
BathPrimer3.0是由加州⼤学戴维斯分校的研究⼈员设计的⼀个基于Primer 3为核⼼开发的引物设计⼯具，可设计多种引物，包括通⽤引物，SSR引物设计和SSR检测和SNP基因分型引物，以及DNA测序引物，当然它最⼤的特点是可以⼀次设计500条序列引物，并且是在线和完全免费的，⽽且速度也是杠杠的。
4.The PCR Suite
这是基于Primer3的基因引物设计的四套程序，可⽤于设计重叠引物（Overlapping Primers），即在⼀个序列中创建多个重叠的PCR引物；只需要⼀个包含⽬的基因的GenBank⽂件，即可在基因组序列
的外显⼦周围设计引物（Genomic Primers）、每个SNP上设计引物（SNPPrimers ）、在开放阅读框架上设计引物（cDNAPrimers）
5.Primerbank
哈佛⼤学的⼀个qPCR引物数据库，⽬前有超过20万条引物，涵盖了⼈和⼩⿏⼤部分已知的基因。根据⽹站上对两万多对引物的验证结果，引物有效率为82.7%。尽量选择这种验证过的qPCR引物，qPCR品质⽐较有保障。（⽂章链接：⼲货 | PCR引物设计，3款在线软件就能搞定！）
6.PrimerX
PrimerX可⽤于⾃动设计⽤于定点诱变的诱变PCR引物，节省时间提⾼效率。基于你所输⼊的序列，PrimerX将模板DNA序列与已经包含所需突变的DNA或蛋⽩质序列进⾏⽐较。然后通过计算编码该突变的适当长度的所有可能的寡核苷酸序列，并遵循指定的指令来产⽣正向引物序列。最后，PrimerX产⽣相应的反向引物序列，并计算其他必需信息，如每个引物对的解链温度和GC含量。
7.BiSearch
科学发展观的基本内涵
特别推荐该软件设计⽤于扩增⾼度冗余的亚硫酸氢盐处理的序列的引物。ePCR⼯具可快速检测cDNA⽂库和天然或亚硫酸氢盐处理的基因组中的错配位点和替代PCR产物。
快速获取通道
辣么多的引物设计软件，闹哄哄、你⽅唱罢、我登场，倒是给⼈⼀种乱花渐欲迷⼈眼的感觉。可即便如此，有些被绕花眼的⼩伙伴依然在PCR之海中浪不起来，被PCR引物狠狠地拍在岸上。
⽽这归根到底是因为他们忽略了⼀点——⽆论⾃⼰设计引物还是交给公司设计引物，只要是设计，其过程就是探索；只要是探索，就必然伴随着不确定性。并且任何引物设计软件都只是依据相应参数、算法来进⾏计算、预测，因此得到的引物仅在理论上是最优的，并不代表实际实验⼀定能出结果。
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因此，⼀对引物究竟好不好⽤，还是需要通过实验来验证的，所谓“实践是检验真理的唯⼀标准”。⽽就⼩编⽽⾔，私认为获得良好PCR引物⽐较科学的流程，应如下图所⽰：
刻楦机图中，获取引物的四种⽅法：颜⾊越偏绿，实验成功率越⾼；颜⾊越偏红，实验成功率越低，但得到引物序列的概率越⾼。
显然，每个⼩伙伴做实验都是依托于实验室这个⼤平台，那么很有可能你所研究的基因是课题组以前做过的，甚⾄还有可能发过论⽂的。都说⼈有⼀张嘴，除了吃，就是说。此时，需要引物的你⼤可以直接询问⾃家的师兄师。掌握要诀：师妹靠卖萌，师弟靠⼲活~
另外，书中⾃有黄⾦屋，这话也是很有道理的。要研究某个基因，怎能不读⼏篇相关⽂献呢？⽽且很有可能某篇⽂献中就已经提供了该基因的荧光定量引物，⽽该引物还是经过作者验证和期刊评审机构核实过的，⼋成是可以给你带来完美的结果。
如果你研究的基因⽐较⼩众，茫茫⽂献中很难钓到提供⽬的基因引物序列的⽂章，那就只能转战数据库了。⽐如上⽂推荐的数据库PrimerBank，就可以提供相关基因的qPCR引物。但如果上述三种⽅法都没能成功，⼩伙伴们就不要再抱着侥幸⼼理了，还是⽼⽼实实设计引物吧。
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