(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010843638.7
(22)申请日 2020.08.20
地址 510000 广东省广州市新港西路105号
(72)发明人 李林妙 陈金平 周佳滨 刘苹
黄文忠
(74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限
公司 44001
代理人 陈洁娣 刘明星
(51)Int.Cl.
C12Q 1/70(2006.01)
C12Q 1/686(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
华硕m5000
(57)摘要
本发明提供了一种通用型冠状病毒PCR引物
及其应用，所述的引物为：上游引物P24F ：5'‑
AACTCAAGCCTTACCGCAGA ‑3'；下游引物P24R：5'‑
ATAGCCCATCTGCCTTGTGT ‑3'。利用本发明提供的
一种通用型冠状病毒PCR引物，仅用普通PCR试剂
和电泳方法即可判定结果，操作简单，成本低廉。
儒家文化的现代价值
的PCR验证，特异性较强，并可以实际应用于各种
高、灵敏度高、成本低、操作简单的特点，可应用
权利要求书1页 说明书3页序列表2页 附图1页CN 112063752 A 2020.12.11
C N 112063752
A
铱星
1.一种通用型冠状病毒PCR引物，其特征在于，所述的引物为：
上游引物P24F：5'-AACTCAAGCCTTACCGCAGA -3'；
下游引物P24R：5'-ATAGCCCATCTGCCTTGTGT -3'。
2.权利要求1所述的引物在制备检测冠状病毒试剂盒中的应用。
3.一种检测冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物。
4.一种检测冠状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样本的病毒RNA，逆转录得cDNA，以待检测样本的cDNA为模板，利用权利要求1所述的通用型冠状病毒PCR引物P24F/P24R进行PCR扩增，鉴定是否含有冠状病毒。
5.根据权利要求4所述的检测冠状病毒的方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为：PCR Mix 12.5μL，ddH 2O 10.5μL，模板1μL，上下游引物10μM各0.5μL，总体系共25μL。
6.根据权利要求4所述的检测冠状病毒的方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。
7.根据权利要求4所述的检测冠状病毒的方法，其特征在于，所述待测样本包括动物的咽拭子、肛拭子、粪便或淋巴结。
权 利 要 求 书1/1页CN 112063752 A
一种通用型冠状病毒PCR引物及其应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通用型冠状病毒PCR引物及其应用。
背景技术
[0002]自20 世纪70 年代以来全世界新发传染病已有40余种，其中80%以上的新发传染病均源自野生动物。动物源性疫病作为一个重要人类公共健康问题，日益受到世界各国的重视。近年来，随着人们对传染性疾病溯源研究的深入，发现野生动物疾病与人类的健康有着直接关系。
[0003]冠状病毒（Coronavirus）是一类可以引发动物以及人类消化道道、呼吸道疾病的病毒，它们是一个大家族，目前已经发现有超过30多种，是RNA病毒里基因组最大的病毒，基
因组约30000个核苷酸大小。直径大小是60
~140纳米，它是一类有囊膜的单链正义RNA病毒。甲基丙烯酸甲脂
sheshefa冠状病毒亚科分为4个属，即α、β、γ和δ。冠状病毒在野生动物中较常见，目前已发现α、β冠状病毒约有29种，主要是感染人和兽类。目前已知的β属冠状病毒包括非典型肺炎冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸道综合症冠状病毒（MERS-CoV）、鼠肝炎病毒（MHV）等，这次爆发的新冠病毒（SARS-CoV-2）也属于β冠状病毒。γ和δ冠状病毒主要感染鸟类，但也发现γ和δ冠状病毒可以感染兽类，比如γ冠状病毒可以感染海狮，δ冠状病毒可以感染猪，导致家养动物致病死亡。重要的是冠状病毒还能够跨物种传播，传染性一旦增强，对动物以及人类会造成严重危害。为了及时发现病原体，切断病原传播，避免遭受损失，迫切需要快速鉴定冠状病毒的方法，尤其是早期鉴定。传统的鉴定方法主要通过荧光定量引物和探针以及ELASA抗体检测等手段，技术性较强，成本较高，因此迫切需要成本低、对仪器和技术人员要求不高、操作简单的检测冠状病毒方法来快速准确的鉴定动物是否携带或感染冠状病毒，从而为预防冠状病毒起到预警的作用。
发明内容
[0004]本发明的第一个目的是提供一种通用型冠状病毒PCR引物，所述的引物为：[0005]上游引物P24F：5'-AACTCAAGCCTTACCGCAGA-3'，如SEQ ID NO.1所示；
[0006]下游引物P24R：5'-ATAGCCCATCTGCCTTGTGT-3'，如SEQ ID NO.2所示。
[0007]本发明的第二个目的是提供上述的通用型冠状病毒PCR引物在制备检测冠状病毒试剂盒中的应用。
[0008]本发明的第三个目的是提供一种检测冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包含上述的通用型冠状病毒PCR引物。
[0009]本发明的第四个目的是提供一种检测冠状病毒的方法，包括以下步骤：提取待测样本的病毒RNA，逆转录得cDNA，以待检测样本的cDNA为模板，利用上述的通用型冠状病毒PCR引物P24F/P24R进行PCR扩增，鉴定是否含有冠状病毒。
[0010]所述的PCR 反应体系为：PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，模板1 μL，上下游引物10 μM 各0.5 μL，总体系共25 μL。
[0011]所述的PCR扩增条件为：94℃ 3 min； 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 5 min。
[0012]所述待测样本包括动物的咽拭子、肛拭子、粪便或淋巴结。
[0013]与现有技术相比，本发明的优势在于：
speck[0014]目前冠状病毒的检测方法主要利用荧光定量PCR引物和探针或是ELASA抗体检测，技术性较强，成本较高。为了能够从含少量病毒样品中快速、高灵敏、低成本地鉴定动物是否携带或感染冠状病毒，本发明提供了一种通用型冠状病毒PCR引物，仅用普通PCR试剂和电泳方法即可判定结果，操作简单，成本低廉。经过各种动物咽拭子、肛拭子、粪便、淋巴结样本的PCR验证，特异性较强，并可以实际应用于各种动物携带或感染冠状病毒的鉴定，具有特异性高、灵敏度高、成本低、操作简单的特点，可应用于动物样本中冠状病毒的特异性检测。
附图说明
[0015]图1为冠状病毒通用引物特异性检测结果。图中，M：Maker；1为健康马来穿山甲的粪便样本；2为死亡马来穿山甲的淋巴结样本；3-4为菊头蝠的肛拭子样本；5-6为滑鼠蛇的咽拭子样本；7为竹鼠的咽拭子样本；8为阴性对照（ddH2O）。
具体实施方式
[0016]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
[0017] 1. 一种通用型冠状病毒PCR引物：上游引物P24F：5'-AACTCAAGCCTTACCGCAG A-3'，下
游引物P24R：5'-ATAGCCCATCTGCCTTGTGT-3'。
[0018] 2. 被检测样本：针对活体动物，用无菌棉签收集动物的咽拭子、肛拭子、粪便等；针对死亡个体，对其解剖采取内脏组织备用。本实施例鉴定的样本为1个健康马来穿山甲的粪便（编号1），1个死亡马来穿山甲的淋巴结（编号2），2个菊头蝠个体的肛拭子（编号3和4），2个滑鼠蛇的咽拭子（编号5和6），1个竹鼠的咽拭子（编号7）。
[0019] 3. cDNA获得：利用病毒提取试剂盒（QIAamp® Viral RNA Mini Kit）提取样本RNA病毒，根据逆转录试剂盒（SuperScript III First-Strand Synthesis System）说明书进行反转录合成单链cDNA；
[0020] 4. PCR扩增：以cDNA为模板，使用普通高效PCR Mix进行PCR扩增，PCR体系为：PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，模板1 μL，上下游引物 (10 μM) 各0.5 μL，总体系共25 μL；扩增条件为：94℃ 3 min；35个循环（94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s）；72℃ 5 min；PCR 扩增目的条带大小约为160 nt。PCR产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图1。[0021] 5. 测序验证：PCR产物切胶回收纯化后送公司进行测序，经分析鉴定其序列均为β-冠状病毒。测序结果：1个健康马来穿山甲的粪便PCR产物测序结果如SEQ ID NO.3所示；1个死亡马来穿山甲的淋巴结PCR产物测序结果如SEQ ID NO.4所示，经NCBI数据库BLAST比对分析，穿山甲携带的病毒序列与穿山甲冠状病毒相似性为10
0%；2个菊头蝠个体的肛拭子PCR产物测序结果如SEQ ID NO.5-6所示，经NCBI数据库BLAST比对分析，蝙蝠携带的病毒序列与蝙蝠类SARS冠状病毒相似性最高，为98.77%；2个滑鼠蛇的咽拭子PCR产物测序结果如
SEQ ID NO.7-8所示，经NCBI数据库BLAST比对分析，滑鼠蛇携带的病毒序列与穿山甲冠状病毒相似性最高，为99.38%；1个竹鼠的咽拭子PCR产物测序结果如SEQ ID NO.9所示，经NCBI数据库BLAST比对分析，竹鼠携带的病毒序列与穿山甲冠状病毒相似性最高，为99.38%。
[0022]经过上述各种动物咽拭子、肛拭子、粪便、淋巴结样本的PCR验证，结果表明，本发明提供的一种通用型冠状病毒PCR引物特异性较强，并可以实际应用于各种动物携带或感染冠状病毒的鉴定，具有特异性高、灵敏度高、成本低、操作简单的特点，可应用于动物样本中冠状病毒的特异性检测。
[0023]以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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