常见致病真菌通用引物PCR检测技术研究

环境与健康杂志2009年11月第26卷第11期J Environ Health,November 2009,Vol．26,No．11

【论著】

文章编号：1001-5914（2009）11-0969-03

金敏1，黄爱华2，陈照立1，谌志强1，邱志刚1，王新为1，王景峰1，李君文1

摘要：目的建立常见致病真菌的通用引物PCR 检测技术，为研究致病真菌的基因芯片检测技术打下基础。方法以真菌的5.8S rRAN 基因和28S rRAN 基因为靶基因，利用其保守序列设计用于常见致病真菌检测的PCR 通用引物，并观察检测方法的特异性及敏感性。结果建立的常见致病真菌通用引物PCR 检测方法可有效检测白念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉等20个种属的致病真菌，敏感性为15pg/ml DNA ，实际应用效果与标准菌株检测结果一致。结论

本研究建立的通用引物PCR 可以用于常见致病真菌的检测。

关键词：真菌；通用引物PCR ；检测中图分类号：R117

文献标识码：A

Detection of Common Fungal Pathogens by Genenral Primer PCR JIN Min,HUANG Ai -hua,CHEN Zhao -li,et al .Institute of Hygiene and Environmental Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Tianjin 300050,China

Abstract:Objective To develop the detection method of common fungal pathogens by general primer PCR.Methods The primers were designed from the target genes of 5.8S rDNA and 28S rDNA of fungi,and the specificity and sensitivity were observed.Results The general primer PCR can be used to detected C.albicans ,C.parapsilosis ,C.krusei ,C.glabrata ,C.tropicalis ,C.neoformans ,A.fumigatus ,A.flavus ,A.nidulans ,A.niger ,C.carrionii ,P.verrucosa ,S.schenckii ,F.pedrosoi ,T.rubrum ,T.mentagrophytes ,M.gypseum ,M.canis ,E.floccosum ,M.racemosus ,the sensitivity was 15pg/ml of DNA.Conclusion The general primer PCR can be used to detect common fungal pathogens.

Key words:Fungi ；General primer PCR ；Detection 基金项目：天津市科技支撑项目(07ZCKFSH01200)

作者单位：1.军事医学科学院卫生学环境医学研究所(天津300050)；2.武警医学院(天津300162)作者简介：金敏(1977-)，女，博士，副研究员，从事微生物检验研究。通讯作者：李君文，Tel:(022)84655345，E -mail:**********************

目前，由环境中致病真菌引起的感染日渐突出。随着肿瘤的放射、化学、广谱抗生素以及免疫制剂的广泛应用，系统性、

机会性真菌感染日益增加，特别是在血液系统恶性疾病、肿瘤和骨髓移植及器官移植中[1]。真菌感染往往是致命的，如念珠菌血症，若不，

死亡率可以达到45%～76%，侵袭性曲霉病死亡率高达55%～70%[2]。真菌感染已成为艾滋病患者的主要死

亡原因[3]。此外，食品和中药材的真菌污染也较严重，给人们的健康带来较大威胁[4]。真菌的检测目前主要依靠常规直接镜检或培养和形态学检测，操作烦琐、费时并且需要高度的专业知识[3]。直接镜检操作简便、快速、实用，阳性结果可以确定真菌感染，但检测阳性率很低，阴性结果不能排除感染，需与培养法结合使用，培养时间一般为4周，且培养法的阳性检出率不高，例如侵袭性念珠菌病血培养的阳性率仅为20%[5]。应用免疫学技术检测真菌目前尚有较多问题，如正常人血清中可能存在某些真菌的抗体，因此无法区分是真菌在体内定植还是感染；此外，抗体检测交叉反应较严重；特异性抗原检测同样存在假阴性和假阳性问题[6]。

车，对保护我国的生态环境，保障人的身体健康和提高居民的生活质量具有重要意义。参考文献：

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交流网（本文编辑：杜宇欣）

969··

环境与健康杂志2009年11月第26卷第11期J Environ Health,November2009,Vol．26,No．11表1用于实验的标准菌株

菌号C1a

C2a

C6a

C4a

Y10 D2q A1

D6a

D8a

D10a D1 3.3440 T1a

T5a

F1d

M3b M2b 10110 49101 52219 32223 51081 8099 50304 3.3885 3.2913 3.2913 3.1409 3.5175

中文名

白念珠菌

热带念珠菌

克柔念珠菌

近平滑念珠菌

光滑念珠菌

新生隐球菌

烟曲霉

黄曲霉

构巢曲霉

黑曲霉

裴氏着真菌

疣状瓶霉

卡式支孢霉

申克孢子丝菌

总状毛霉

红毛癣菌

须癣毛癣菌

絮状表皮癣菌

公民社会理论犬小孢子菌

石膏样小孢菌

铜绿假单胞菌

变形杆菌

小肠结肠炎耶尔森菌

粪链球菌

鲍氏志贺氏菌

大肠埃希氏菌

沙门氏菌

杂曲霉

桔青霉

周蕾禾谷镰刀菌

赭曲霉

扩张青霉

拉丁名

Candida albicans

Candida tropicalis

Candida krusei

Candida parapsilosis

Candida glabrata

t检验法

Cryptococcus neoformans

Aspergillus fumigatus

Aspergillus flavus

Aspergillus nidulans

Aspergillus niger

Fonsecaea pedrosoi

Phialophora verrucosa

Cladosporium carrionii

Sporothrix schenckii

Mucor racemosus

Trichophyton rubrum

Trichophyton mentagrophytes

Epidermophyton.floccosum

Microsporum canis

Microsporum gypseum

Pseudomonas aeruginosa

Proteus sp.

Yersinia enterocoliti

Enterococcus faecalis

Shigella boydii

Escherichia coli

Salmonella sp

Aspergillus versico

Penicillium citrinum

Fusarium graminearum

Aspergillus ochraceus

Penicillium expansum

来源

CMCC

国旗与国家

CMCC

CGMCC

分子生物学的出现使得致病微生物的检测技术得到很大发展。常见的分子生物学技术包括G+C%测定、基因探针技术、基因测序、PCR及相关技术(套式PCR、荧光定量PCR技术等)、核酸多态性技术(RAPD，RFLP)等。PCR及其相关技术具有灵敏、快速，所需样品量少等优点[7-13]。本研究建立了常见致病真菌的通用引物PCR检测技术，一次PCR可以检测几乎所有的致病真菌，如果结合基因芯片技术，可以对常见致病真菌进行快速、高通量的检测与鉴定，为致病真菌感染快速诊断或环境污染快速检测打下基础。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1仪器与试剂PCR仪（英国Techne公司），Gel Doc 1000凝胶成像系统（BioRad公司），3902型

DNA合成仪（美国Applied Biosystem公司），电泳仪（北京六一仪器厂）。Taq 酶、dNTP mixture、琼脂糖等分子生物学试剂均购自大连宝生物公司。

1.1.2标准菌株本实验使用的标准菌株均来自中国医学菌种保藏管理中心（CMCC）、中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，见表1。1.2实验方法

1.2.1真菌培养条件的建立酵母菌的培养方法采用沙堡固体或液体培养基，30℃培养2d；其他真菌培养方法采用马铃薯固体或液体培养基进行培养，28℃培养5～7d。

1.2.2检测靶基因真菌的5.8S rRAN基因和28S rRAN基因间区。

1.2.3核酸序列的获取与多序列比对登录GenBank( ncbi.v/entrez)，在核酸数据库中检索相关真菌的靶基因序列，逐个核对后筛选出测序质量较好的序列。用vector NTI SUITE6.0软件中的alignment将筛选出的序列进行多序列比对，得到碱基对齐图。

1.2.4通用引物的设计通用引物的设计原则参考文献[14]。根据真菌核酸多序列比对图，综合考虑通用引物设计原则，在靶基因的保守区应用oligo6.0软件寻适于作为通用引物的序列，得到候选序列后进行BLAST比对，筛选出理论上最好的通用引物进行合成。本实验所用的通用引物为大连宝生物公司合成，HPLC纯化。

1.2.5真菌DNA提取方法采用氯化苄提取真菌DNA[15]。于1.5ml离心管中加入600μl DNA提取液（100mmol/L Tris-HCl，40mmol/L EDTA,pH=8.0）悬浮菌体，振荡使之与菌体混匀。加入10%SDS50μl，加入氯化苄300μl，剧烈振摇，使管中混合物成乳状，50～55℃水浴1h，每5min振荡混匀一次。每管加入3mol/L 的乙酸钠（pH=5.2）60μl，冰浴20min，12000×g4℃离心10 min。取上清，加等体积的酚/氯仿混合液（V/V=1∶1）抽提，12000×g4℃离心10min，取上清加1/10体积的乙酸钠及等体积的异丙醇，-20℃放置1h，12000×g4℃离心10min。弃上清并加入40μl75%乙醇，清洗管壁,12000×g4℃离心10min，弃上清干燥，加入适量Tris-EDTA缓冲液，-20℃保存。

1.2.6通用引物扩增的实验用设计的通用引物对各种选定的真菌进行PCR扩增并均采用50μl反应体系，反应体系为：10×反应缓冲液5μl；DNA模板2μl；Taq酶（5U/μl）0.2μl；dNTP mixture（2.5mmol/L）4μl；引物各2μl；其余为双蒸水。PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。反应结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物情况。

2结果与讨论

2.1通用引物设计的结果

根据各种属真菌核酸碱基比对图，发现不同种属间在5.8S rDNA和28S rDNA区域较保守。为了能够扩增出各种属真菌的此区域核酸，在5.8S rDNA基因设计上游引物SH（5＇-gcatcgat－gaagaacgcagc-3

＇），在28S rDNA基因设计下游引物XI(5＇-tcctc－cgcttattgatatgc-3＇)。

2.2通用引物PCR检测致病真菌特异性

利用优化的通用引物PCR反应条件对选择的20种常见致病真菌进行检测，结果见图1。

利用通用引物SH与XI在相同的条件下对实验所涉及的真菌标准菌株与选择的细菌标准菌株进行PCR扩增。从PCR 检测结果可以看出，通用引物PCR对常见致病真菌可以扩增出希望的目的片段(经过测序分析，均与标准菌的核酸序列一致，结果未给出)，而对所选的细菌菌株，包括铜绿假单胞菌、变形杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、粪链球菌、鲍氏志贺菌、大肠埃希菌、

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环境与健康杂志2009年11月第26卷第11期J Environ Health,November 2009,Vol．26,No．11

沙门菌的扩增结果均为阴性，显示出本方法检测真菌的特异性较好。

2.3

通用引物PCR 检测致病真菌的敏感性

关于PCR 检测真菌的敏感性没有统一的定义，笔者将其定

义为，利用真菌通用引物SH 和XI 对样品DNA 稀释液进行扩增后，10μl PCR 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳检测中可产生阳性信号的DNA 最低浓度。本研究以烟曲霉核酸为代表，取其DNA 15、1.5ng/ml 以及150、15、1.5pg/ml ，分别进行PCR 扩增，然后进行电泳检测。结果显示，

通用引物PCR 检测真菌核酸可以达到150pg/ml 的DNA （图2）。由此可见，通用引物PCR 检测致病真菌具有较高的敏感性。

2.4

通用引物PCR 检测致病真菌初步应用

收集从临床样品、环境样品和食品中分离的真菌菌株共90株，并经过常规方法鉴定，包括白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、

克柔念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、裴氏着真菌、疣状瓶霉、卡式枝孢霉、申

克孢子丝菌、总状毛霉、红毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌等。经过本研究建立的通用引物PCR 检测，全部得到阳性结果。3小结

以真菌的5.8S rRAN 基因和28S rRAN 基因分别设计上游和下游引物，建立的通用引物PCR 技术可以检测20余种常见的致病真菌，该方法的特异性较好，敏感性高，为进一步研究致病真菌的基因芯片检测技术打下了基础。参考文献：

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（收稿日期：2009-02-05修回日期：2009-08-12）

（本文编辑：

杜宇欣）图120种常见致病真菌通用引物PCR 扩增琼脂糖

凝胶电泳结果

1—申克孢子丝菌；2—裴氏着真菌；3—红毛癣菌；4—须癣毛癣菌；5—石膏样小孢菌；6—犬小孢子菌；7—絮状表皮癣菌；8—总状毛霉；

M —DNA marker2000

1—白念珠菌；2—近平滑念珠菌；3—克柔念珠菌；4—光滑念珠菌；5—热带念珠菌；6—新生隐球菌；7—烟曲霉；8—黄曲霉；9—构巢曲霉；10—黑曲霉；11—卡式支孢霉；12—疣状瓶霉；M —DNA marker 2000

2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp

大胆爱小心偷2000bp

1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp

图2烟曲霉核酸通用引物PCR 扩增敏感性结果M —DL2000DNA marker ；1—15ng/ml ；2—1.5ng/ml ；3—150pg/ml ；

4—15pg/ml ；5—1.5pg/ml

2000bp

1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp

971··

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