《癌症》Chinese Journal of Cancer，2010，29（1）：32－37
·基础研究·
四川成都610041
2．四川大学华西医院
生物国家重点实验室
麻醉与危重病医学研究室，
四川成都610041
1．Department of Medical Oncology，Sichuan Cancer Hospital，Chengdu，610041，Sichuan，P．R．China
2．Department of Anesthesia
母亲和我们and Critical Care Medicine of
State Key Laboratory of Biotherapy，West China Hospital，
West China Medical School，Sichuan University，
Chengdu，610041，Sichuan，P．R．China
通讯作者：梅开Correspondence to：Kai Mei Tel．：86．28．85420660
Fax：86．28．85420116
E-mail：meikai1973＠yahoo．com．cn
基金项目：四川省卫生厅课题（No．070028）
Grant：Foundation of Health Department of Sichuan Province （No．070028）
收稿日期：2009-05-06
接受日期：2009-09-23［Abstract］Background and Objective：Studies have shown that nitric oxide （NO）derived from endothelial nitric oxide synthase（eNOS）is expressed widely in tumor tissues and regulates tumor angiogenesis．However，the results are controversial．This study was to inve
stigate the effect of NO on tumor angiogenesis and its mechanism．Methods：C57BL／6mice inoculated with Lewis lung cancer cells were randomly divided into three groups．Mice in the NO group were inoculated with lung cancer cells transfected with eNOS gene，mice in the L-NAME group with L-NAME，an eNOS antagonist，and mice in the control group with normal saline．Plasma concentration of NO and the number of endothelial progenitor cells（EPCs）in peripheral blood were detected．Tumor vessel density，CD133＋cells，and the expression of VEGF-VEGFR in tumor tissues were also measured．Results：Four weeks after inoculation of Lewis cells，tumor volume was significantly larger in control group［（3022±401）mm3］than in the L-NAME group［（1204±97）mm3］and in the eNOS group［（1824±239）mm3］（P＜0．01）．eNOS protein and NO production increased significantly in Lewis lung cancer cells transfected with eNOS gene．But the number of CD133-positive cells and vessel density in tumors were significantly lower in the eNOS group than in the control group ［（48±19）／HPF vs．（103±27）／HPF，（19±7）／HPF vs．（31±9）／HPF，P＜0．05］．The number of EPCs in peripheral blood was not statistically different between each group．The levels of NO in blood and tumor tissue significantly decreased after the treatment of L-NAME，while the tumor vessel density reduced to12±5／HPF（P＜0．01，vs．the control group；P＜0．05，vs．the eNOS transfected group）．The number of EPCs in blood and that of CD133-positive cells in tumor tissue were significantly smaller in the L-NAME grou
p than in the control group（P＜0．05）．Conclusion：NO derived from eNOS inhibits angiogenesis and tumor growth，which may be due to its suppression on either the mobilization or homing of EPCs via VEGF binding to VEGFR．
Key words：endothelial nitric oxide synthase，nitric oxide，endothelial progenitor cells，tumor angiogenesis，vascular endothelial growth factor
【摘要】背景与目的：内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）来源的一氧化氮（nitric oxicle，NO）广泛表达于肿瘤组织，调节着肿瘤血管的生长，但研究结果并不一致。本研究中探讨NO对肿瘤血管形成的作用及其机制。方法：将C57BL／6小鼠随机分为3组：NO组小鼠右胁下接种eNOS基因转染的Lewis肺癌细胞；eNOS拮抗组小鼠接种Lewis肺癌细胞后腹腔注射eNOS拮抗剂L-NAME；对照组接种Lewis肺癌细胞后注射同等体积的生理盐水。处理3周 内皮型一氧化氮合酶来源的NO调节
肿瘤血管的生成
梅开1，蔡晓虹1，杜磊2，陈艳芳2，黄霜1，陈晶1，
尹序德1，张芷旋1，赵新1，周澄亚1，喻璟瑞1
Effect of nitric oxide derived from endothelial nitric oxide synthase on tumor angiogenesis
Kai Mei，1Xiao-Hong Cai，1Lei Du，2Yan-Fang Chen，2Shuang Huang，1Jing Chen，1 Xu-De Yin，1Zhi-Xuan Zhang，1Xin Zhao，1Cheng-Ya Zhou1and Jing-Rui Yu1 32
一氧化氮（nitric oxicle，NO）是NO合酶（NOS）以L－精氨酸和氧为底物合成的多功能小分子气体物质，具有较高的自由基活性，参与并调节多种生理和病理生理过程，如参与新生血管的形成。NOS具有3种亚型，神经型NOS（nNOS）、诱导型（iNOS）和内皮型（eNOS）。近年的研究发现，eNOS 不仅表达于正常组织，在肿瘤组织中也广泛表达［1］，并通过生成NO，调节内皮细胞的破坏［2］和骨髓内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）的动员及归巢［3］，参与血管的生成，从而影响肿瘤的生长和转移。因此，通过干预NOS的活性调节NO的生成，可能成为肿瘤的手段。然而，大量研究得出的矛盾结果却让人难以适从：如非小细胞肺癌组织中eNOS阳性率89％，强阳性表达患者的生存率优于弱表达的患者［4］，提示eNOS来源的NO抑制肿瘤生长。但将eNOS基因敲除或使用L-NAME选择性抑制eNOS活性，也能抑制外周血管内皮祖细胞的归巢［5］和肿瘤新生血管的形成［6］，说明NO能促进新生血管的形成。
NO是一种活跃的小分子物质，其作用效果具有显著浓度依赖性：低浓度NO能与O2－反应，减轻O2－对组织的损伤［7］，但高浓度的NO可直接损伤组织［8］。是否新生血管的形成也依赖于NO的浓
度？本研究利用小鼠Lewis肺癌模型，研究eNOS来源的NO是否浓度依赖性调节肿瘤新生血管的形成及调节机制。
1材料与方法
1．1质粒构建、肿瘤细胞的转染和鉴定
将编码eNOS基因的cDNA（Invitrogen公司）经PCR扩增，PCR扩增所需引物序列为：上游5′-ATCTGATGCTGCC-3′，下游5′-GTTACTGTGCGT-3′（上海基康生物技术有限公司合成）。将扩增所得到的eNOS DNA片段连接至真核表达载体pcDNA3．1（Invitrogen公司，Number：V795-20）Eco RⅠ位点，构建重组质粒pcDNA3．1-eNOS（9kb），并经Eco R Ⅰ及XhoⅠ酶切鉴定。细胞转染用pcDNA3．1-eNOS 质粒、pcDNA3．1空质粒经纯化试剂盒（Qiagen公司）纯化，质粒DNA浓度以紫外分光光度计确定，纯化的质粒存于－20℃冰箱，备用。
将Lewis肺癌细胞（细胞株由四川大学华西医院国家重点实验室提供）接种于6孔板中，待细胞生长至平铺板底60％～70％时准备转染。依照Lipofectin转染试剂盒（Invitrogen，San Diego，CA，USA）操作说明进行。收集细胞，每孔细胞以2μg pcDNA3．1-eNOS质粒或空质粒与4μg Lipofectin 混合于无血清DMEM培养基（Gibco BRL公司）中，37℃孵育12h，将培养液更换为含血清的DMEM 培养基，继续培养，约60h后收集培养上清液－80℃保存，用于eNOS蛋白检测。待转染后的细胞稳定生长
后分别收集以上两种对数生长期的细胞，用于接种小鼠。同时培养未经转染的Lewis肺癌细胞，收集相同数量的对数生长期细胞。
小鼠eNOS-ELISA试剂盒购自Uscnlife公司。Lewis细胞转染后72h，收集培养细胞，离心沉淀后溶解，再离心，取上清液测定eNOS蛋白表达，检测方法按试剂盒说明操作。
1．2肿瘤模型的建立与分组处理
37℃5％CO2条件下培养Lewis细胞，收集对数生长期的细胞，离心、细胞沉淀、洗涤后，接种于6～8周龄、体重20g左右的C57BL／6雌性小鼠（合格证号：0006549）右胁部皮下，建立肿瘤模型（每只接种1×106个细胞）。
随机数字法将小鼠分为3组，每组10只。转染组：小鼠接种转染pcDNA3．1-eNOS后稳定生长的Lewis细胞；L-NAME组：小鼠接种正常培养的Lewis细胞7d后（肿瘤直径约0．5cm），腹腔内注射L-NAME［20mg／（kg·d）］；对照组：小鼠接种正常培养的Lewis细胞7d后，腹腔内注射与L-
后，测定血浆内NO含量，计数外周血中内皮祖细胞（EPC）
数；取肿瘤组织测定每高倍视野下（HPF）血管密度、EPC细
胞数量和血管内皮细胞生长因子及其受体复合物（VEGF-
VEGFR）的表达。结果：接种Lewis细胞4周后，对照组肿
瘤体积为（3022±401）mm3，而L-NAME组和eNOS组分别为
（1204±97）mm3和（1824±239）mm3，三组比较有显著性差异
（P＜0．01）。eNOS基因转染组肿瘤组织内eNOS蛋白表达和
NO的生成显著高于对照组，但肿瘤组织中EPC数量［（48±
19）／HPF］、血管密度［（19±7）／HPF］显著低于对照组（P＜
0．05），循环EPC数量与对照组比较无显著变化。L-NAME
腹腔注射能显著减少血液及肿瘤组织内NO浓度，循环EPC
安全域
数量和肿瘤组织内EPC数量也随之显著降低，肿瘤血管密
度也降至（12±5）／HPF，与对照组及eNOS转染组比较差异
有统计学意义（P＜0．05）。结论：eNOS来源的NO低表达和高
表达时都能通过减少VEGF与其受体的结合而抑制EPC参
与的肿瘤新生血管的生成和肿瘤的生长。
关键词：一氧化氮合成酶，内皮型；血管内皮生长因子；内
皮祖细胞；肿瘤血管
中图分类号：R73-3文献标识码：A
文章编号：1000－467X（2010）01－0032－06
梅开，等．内皮型一氧化氮合酶来源的NO调节肿瘤血管的生成33
NAME组同等体积的生理盐水。以上处理结束后观察3周，每4d测定肿瘤体积（长×宽2×0．52），并在观察结束后取小鼠外周血和肿瘤组织检测。
1．3血浆NO产物、VEGF含量的测定
处死动物前开胸，使用肝素管直接心内取血，311×g离心10min后取上清液（血浆）备用。NO的半衰期仅数秒钟，因此本研究测定NO代谢产物亚硝酸盐的含量来间接反映NO的生成。血浆型NO测定试剂
盒（硝酸还原酶法）购自南京建成生物工程公司，按试剂盒所提供步骤进行操作。
1．4流式细胞术测定血液EPC
将血液中有核细胞制备成单细胞悬液。取1×106个细胞经PBS洗涤后，加入用FITC（CD133）、PE（CD34）和PE-CY7（KDR）（购自BD BioSciences 公司）的抗体来标记细胞膜上的抗原，同时加阴性对照管，室温孵育20min。用PBS洗一遍后弃上清，300μL PBS重悬细胞，上机检测。
1．5ELISA法检测肿瘤组织eNOS蛋白的表达取0．4mg肿瘤组织后，在冰浴上超声匀浆，然后4℃下10000×g离心20min，取上清。按试剂盒说明测定eNOS。
1．6肿瘤组织血管密度测定
按参考文献方法［9］进行：免疫组化ABC法（ABC 免疫组化试剂盒购自Vector Laboratories公司），采用CD31抗体对肿瘤组织冰冻切片微血管染，双盲法随机观察10个高倍视野（HPF），计数切片中微血管数目，计算每高倍视野下平均微血管数，从而得出肿瘤组织微血管密度。纯化的大鼠抗小鼠CD31（PECAM-1）单克隆抗体购自BD BioScience 公司。
1．7肿瘤组织内CD133＋细胞染和VEGF-VEGFR2复合物
CD133＋细胞染采用免疫荧光法，一抗（山羊抗小鼠CD133抗体）购自Santa Cruz公司，二抗（猪抗山羊）购自SBA。为探讨NO对CD133＋细胞归巢影响的机制，本研究利用VEGF-VEGFR2复合物特异性抗体GV39M［10］，免疫组化ABC法标记VEGF-VEGFR2复合物。操作步骤同1．5，相应抗体购自BD BioScience和EastCoast Bio公司。
1．8统计学分析
采用SPSS13．0软件进行统计学分析，所有数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0．05认为差异有显著性。2结果
2．1转染细胞中eNOS的表达
Lewis肺癌细胞转染后，eNOS蛋白表达增加，与对照组比较有显著性差异。
2．2肿瘤体积的变化
图1显示，接种Lewis细胞4周后，对照组肿瘤生长至（3022±401）mm3，而L-NAME组和eNOS 组肿瘤体积分别为（1204±97）mm3和（1824±239）mm3，与对照组比较有显著性差异（P＜0．01）。提示无论使用L-NAME阻断NO生成还是eNOS转染增加NO生成，均能抑制肿瘤的生长。
2．3肿瘤组织eNOS表达和血清NO含量对照组肿瘤组织内eNOS蛋白的含量和血浆内NO含量分别为（105±36）pg／mg和（10．5±4．2）μmol／L。图2显示，腹腔内注射L-NAME不能改变肿瘤组织内eNOS蛋白的含量，但能显著抑制NO 的生成（3．8±1．9）μmol／L（P＜0．01）；而转染eNOS 基因组肿瘤组织内eNOS蛋白的含量增加至（382±75）pg／mg，血浆NO浓度也升高至（19．7±3．6）μmol／L，显著高于对照组（P＜0．01）。
2．4肿瘤组织微血管密度
图3显示，对照组平均微血管数量为（31±9）／HPF，显著高于eNOS转染组的（19±7）／HPF，两组相比差异有统计学意义（P＜0．05）。L-NAME组微血管密度最低［（12±5）／HPF］，与对照组和eNOS转染组相比差异有统计学意义（P＜0．05）。
2．5循环血内皮祖细胞计数
本研究使用CD133＋、CD34＋和KDR＋标记循环图13组小鼠肿瘤体积的变化
Figure1Tumor volumes in3groups of mice Treatment with both L-NAME and transfection of endothelial nitric oxide synthase（eNOS）gene resulted in significant inhibition of tumor growth compared with control．
梅开，等．内皮型一氧化氮合酶来源的NO 调节肿瘤血管的生成34
图5
肿瘤组织CD133＋细胞数量（免疫荧光染×400）
Figure 5The number of CD133＋cells in tumor tissue
（immunofluorescence ×400）
The number of CD133＋cells in tumor tissue is significantly smaller in the L-NAME group and the eNOS group than in the control group （P ＜0．01and P ＜0．05，respectively ）．
EPC 。图4显示，对照组外周血循环EPC 数量为
（34±5）个／mL 全血；经L-NAME 处理后，EPC 数量为（18±4）个／mL ，与对照组比较差异有统计学意义（P ＜0．05）。eNOS 基因转染组循环EPC 数量为（26±
6）个／mL ，与对照组比较差异无统计学意义（P ＞0．05）。
2．6肿瘤组织内CD133＋细胞归巢
成熟血管内皮细胞仍能表达CD34和KDR ，因
此本研究中我们使用CD133抗原标记肿瘤组织内归巢的血管EPC 。图5显示，未做任何处理的荷瘤
图2
肿瘤组织内eNOS 蛋白的表达和血浆内一氧化氮含量
Figure 2eNOS expressions in tumor tissue and nitric oxide
（NO ）levels in plasma of three groups of mice
After 3weeks of treatment ，
the expression of eNOS in tumor tissue
（A ）and plasma level of NO （B ）are significantly higher in the eNOS
group than in other two groups （P ＜0．05）；plasma level of NO is
significantly lower in the L-NAME group than in other two groups （P ＜
0．01）．
图3肿瘤组织微血管密度（免疫组化ABC 染×400）hcap
Figure 3Microvessel density of tumor tissue （IHC ABC ×400）
Microvessel density of tumor tissue is significantly lower in the L-NAME group and the eNOS group than in the control group （P ＜0．01and P ＜0．05，respectively ）．
图4小鼠外周血循环中EPC 细胞数量
Figure 4
The number of EPCs in peripheral blood circulation
of mice
The number of EPCs in peripheral blood circulation is significantly smaller in the L-NAME group than in the control group （P ＜0．01）．
The number of EPCs shows no significant difference between the
eNOS group and the control group （P ＞0．05）．
梅开，等．内皮型一氧化氮合酶来源的NO 调节肿瘤血管的生成马提尼克岛 长高
35
小鼠肿瘤组织内归巢EPC 为（103±27）／HPF ；如荷瘤小鼠腹腔内注射L-NAME ，则其肿瘤组织内EPC 数为（29±11）／HPF （与对照组比较，P ＜0．01）；若小鼠接种eNOS 转染的Lewis 肺癌细胞，肿瘤组织内
EPC 数为（48±19）／HPF ，显著低于对照组（P ＜0．01），但高于L-NAME 组（P ＜0．05）。2．7
循环VEGF 表达和肿瘤内VEGF-VEGFR 2复合物的表达
免疫组化染显示，VEGF-VEGFR 2复合物在各组动物的肿瘤组织内均有不同程度的表达，而在L-NAME 组和eNOS 转染组，VEGF-VEGFR 2复合物
的表达低于对照组（图6A ）。
ELISA 测定显示，对照组与eNOS 转染组动物
血浆VEGF 浓度相似［（47．5±12）pg ／mL vs．（48．3±
18）pg ／mL ，P ＞0．05）］，L-NAME 组VEGF 浓度为
（22．5±7）pg ／mL ，与其他两组相比有显著性差异（P ＜0．05），见图6B 。
3讨论
肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管的形成，抗血管已成为肿瘤的重要措施。NO 参与肿
瘤新生血管的生成过程［1］，可能成为抗血管的靶点。因此，NO 对肿瘤血管形成的影响机制成为研究的重要课题。但NO 对肿瘤的作用受NO 的来源、浓度以及肿瘤类型的影响［1］，其机制尚不十分清楚。本研究发现，使用eNOS 阻断剂L-NAME 减少外周血循环内NO 浓度后，肿瘤组织内的微血管密度会随之降低；而将eNOS 基因转染至肿瘤细胞，接种后形成的肺癌组织微血管密度也低于未转染组，提示过高或过低浓度的NO 均可影响肿瘤血管的形成。
与正常血管不同的是，肿瘤血管的内皮层并不连续。尽管如此，血管内皮细胞的延伸仍是血管形成的重要条件［11］。延伸的内皮细胞可能来源于邻近内皮细胞的分裂和循环EPC 。由于邻近的细胞是成熟的内皮细胞，分裂并不活跃，因此EPC 可能在血管形成中发挥极其重要的作用［2，4］。EPC 主要来源于骨髓，是成熟内皮细胞的前体细胞，控制血管的修复和新生血管的形成［11，12］。2006年，
Shaked 等［13］研究发现，化疗药物破坏肿瘤后导致骨髓释放大量
酶制剂EPC ，这些EPC 迅速在肿瘤边缘聚集，形成新的血
管，提示EPC 的动员和归巢是新生血管生成的重要条件。
NO 是否参与EPC 的动员和归巢而调节肿瘤
微阵列血管的形成？EPC 表面表达CD133＋、CD34＋、
VEGFR 2＋（KDR ，血管内皮生长因子受体2）。本研究
中采用流式细胞术检测外周血循环中的EPC ，免疫组化法标记肿瘤组织中CD133＋的EPC 。结果发现，荷瘤小鼠腹腔内注射eNOS 抑制剂L-NAME 后，随着血清NO 浓度和肿瘤组织内NO 含量的下降，血循环中EPC 的数量随之从每毫升全血中34个下
降至18个，肿瘤组织内CD34＋细胞数量也显著下降，提示eNOS 来源的NO 生成下降能同时减少
EPC 的动员和归巢，从而减少肿瘤血管的生成。
尽管目前的证据还不能证明eNOS 来源的NO 能直接诱导骨髓来源的EPC 的动员和归巢，但有证据表
明NO 在VEGF 诱导的EPC 动员和归巢中扮演十分重要的角［2，3］。VEGF 与其靶细胞（如血管内皮细胞和成纤维细胞）上的受体VEGFR 2（KDR ）结合，可以增加EPC 的化学趋向性，促进细胞分裂和毛细血管出芽生长，使内皮细胞穿透基质形成新生血管［12，14］。如将eNOS 基因敲除后，VEGF 注射不能增加外周循环中和缺血组织内归巢的
EPC 数量［15］，说明NO 是调节VEGF 诱导血管生成
的重要物质。NO 是否通过VEGF 调节EPC 的动员
图6
血浆VEGF 浓度和肿瘤组织VEGF-VEGFR 2复合物
（免疫组化ABC 染×400）
Figure 6Plasma VEGF level and the VEGF-VEGFR 2
compound expression in tumor tissue （IHC ABC ×400）
The expression of VEGF-VEGFR 2compound （A ，arrow ）in tumor tissue is significantly higher in
the control group than in the L-NAME group and the eNOS group．However ，plasma VEGF level （B ）is similar in the control and the eNOS groups ，and significantly higher in the control group and the eNOS group than in the L-NAME group （P ＜0．01）．
梅开，等．内皮型一氧化氮合酶来源的NO 调节肿瘤血管的生成
36
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