网络出版时间：2221 -3 -18 15 ：27 网络出版地址：htt p s ://kns . cnki. net/kcms/detail/34. 1265. R. 22212317. 1519. 021. html
◊基础医学研究^
克雷伯菌易感性的研究
苏丛1 23
，伍婷1徐方明1陈昊然3刘艳艳律娜1兰燕虎李家斌97442222 -W-H 接收
基金项目：国家自然科学基金（编号：81673242、81973983）㈤.年
度安徽高校自然科学研究项目（编号:KJ2018A0193 ）;
am 安徽省高校优秀拔尖人才培育（编号:gxyqq018010）
作者单位：安徽医科大学附属巢湖医院感染病科，巢湖733000 2安徽医科大学第一附属医院感染病科，合肥7370273安徽省细菌耐药性监控中心，合肥737027
4安徽医科大学细菌耐药研究所，合肥737027
作者简介：苏丛，女，硕士研究生；
兰燕虎，男，博士，责任作者,E-mail ： zixinhu@ 199. com ；
李家斌，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-
mail : lijiaain@ ahmu. etu. cn
摘要目的通过建立Lamta2巨噬细胞条件敲除小鼠感
染肺炎克雷伯菌（Kp ）模型，初步研究Lamtor2基因生物学功 能及其在Kp 感染过程中的相关机制。方法 将引进的
Lamto2r *小鼠自交,Lyz2-Cre 小鼠与Lamtor2*""*进行杂
交，获得基因型为 Lamtor2flr/flr Lyz2-Cre --和 Lamtor2flr/*
Ly2-Cre “-的子代小鼠；将上述两种基因型子代小鼠进行杂
交，得到对照组小鼠（Lamtor2fIr/fIi Lyz2-Cre -/-）和 Lamtor2 条件性基因敲除小鼠（Lamtor2flr/flr Lyz2-Cre*/-）。提取小鼠
脚趾基因组DNA ，经聚合酶链式反应（PCR ）扩增，通过琼脂 糖凝胶电泳鉴定子代小鼠基因型并提取肺泡巨噬细胞，利用 qRT-CCR 和Western blot 验证Lamtor2基因敲除效果。小鼠
感染Kp，观察生存状况；体外采用RT-c PCR 检测Kp 感染肺 泡巨噬细胞肿瘤坏死因子（TNF ）-a 、白细胞介素（（L ）-lp 和
CxclO 表达水平，两组间比较采用t 检验;Western b/e 验证 iNOS 的表达水平。结果 成功建立Lamtor2条件性基因敲
除小鼠模型，子代存活且可育；与对照组小鼠比较，实验组小
鼠在感染Kp 后生存率降低;Lamtor2flr/flr Lyz2Ce “-小鼠来
源的肺泡巨噬细胞中的TNF c （i = 17. 54,P=2.023 2）、IL -
9（ = 15. 37,P= 2. 024 2）和 CxclO （ =37. 82,P =2. 502 7）
表达水平降低，且iNOS 表达下降。结论 构建了 Lamtor2
条件性基因敲除小鼠，感染肺炎克雷伯菌后，小鼠的生存率 下降；肺泡巨噬细胞1NOS 表达降低。
关键词Lamtor2；条件性基因敲除；繁育；肺炎克雷伯菌21世纪经济大趋势
中图分类号R337
文献标志码A 文章编号1002-1492（2221）24 - 2525 - 25
doi ： 12.19425// cnki. iss/1902 - 1927. 0271.04. 021
近些年，肺炎克雷伯 菌（klebsiella phumohar ,
Kp ）的高致病性感染在世界范围内不断被报道一4 ,
人类健康也因此受到严重威胁。当微生物侵入机体
时，巨噬细胞首先对病原体发挥吞噬作用，此为固有
免疫；而晚期核内体溶酶体适配器（late eekosomal/ly-
sosomal adaptor 2,Lamtor2）在吞噬的发生过程中发挥
重要作用;Lamtor2也是丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK ）以及哺乳动物雷帕霉素（mTOR ）激活物/调
节剂复合物2的靶点［5］0巨噬细胞在抗感染免疫过
程中，巨噬细胞的Lamtor2分子与细胞向M9分化及 其对病原菌杀伤力密切相关。该实验通过构建、饲
养、繁育和鉴定Lmto2条件性基因敲除小鼠，获得
LmtoT■2"a/lao Lyz2-Cre +/_ 鼠，建立 Lamtor2 巨噬细胞
条件敲除小鼠感染Kp 模型，为探究Lamtor2基因在
抗Kp 感染免疫过程中的机制提供线索。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物 Lamtor2flr/*小鼠共3只，雌鼠9 只、雄鼠2只；Lyz2-Cre 工具鼠共2只，雌、雄各9
只，均购自赛业（广州）生物科技有限公司,2 ~37 g/6周龄，小鼠品系为C47BL//J ，无特殊病原体
（SPF 级），实验动物生产许可证号:SCXK （粤） 0437，使用许可证号：SYXK （皖）ZU - OU ；伦理审
批号:LLSC22192243O 实验过程遵循3 R 原则。
1.1.0试剂与仪器 基因组DNA 提取试剂盒（货
号:J L5852）购自北京天根生化科技有限公司;Taq
PCR Master Mix （货号:RR921 ）、TB Greer Premia Ex
Taq™1 （货号:RR422）以及 DL2 02 bp DNA marker
（批号:A1A4439）均购自日本TaKaRa 公司；琼脂糖
粉（批号nnej ）购自上海生工生物工程股份有限
公司。P-Actia 抗体（货号:so -47773）购自美国Santo Cez 公司；iNOS 抗体（货号：AFU.）购自美国Af- finitp 公司；二抗山羊抗IgG/辣根酶标记［货号:ZB- 2345（抗鼠）、ZBA341（抗兔）］购自北
京中杉金桥公
司。
荧光定量PCR仪（罗氏LightCycler96，瑞士），基因扩增仪（Biometra Tonr，德国），Western blot电泳仪（Bio-Rad，美国），凝胶电泳成像仪（Tanon 0266Multi，上海天能）。
1.2实验方法
1.2.1小鼠的饲养与繁殖根据国家实验动物饲养和使用指南，将小鼠饲养于安徽医科大学SPF级动物房中，室温控制在22~25°C，湿度50%-60%，保证12h光照，昼夜交替[7]0饲养过程中保持无菌环境，观察并记录小鼠生长发育情况。将性成熟（6~9周龄）的雌鼠与其中一只雄鼠同笼合养进行繁殖，每周给予灭菌的蛋黄和瓜子补充营养。小鼠的平均发情周期为4-0d，发情时间约26h，妊娠期12-22d，子代出生后22~22d断奶分笼，雌性幼鼠和雄性幼鼠分笼饲养。
1.2.2小鼠亲代及子代信息记录为详细记录繁殖后代的信息，设计亲代和子代标签，在亲代标签中，针对小鼠的笼号、基因型、出生日期、周龄、合笼日期、产仔日期和数量进行详细记录；在子代标签中，对幼鼠的笼号、出生日期、周龄、来源笼进行详细记录。
1-2-2小鼠基因型鉴定鼠出生后3~4周与母鼠分笼，剪取小鼠脚趾6.3~6.5cm置无菌1.5ml EP 管中，并
依据剪取的不同脚趾标记小鼠。用基因组DNA提取试剂盒提取小鼠基因组DNA，所得样品置-22C保存。采用PCR法”皿基因上游引物：5，-CCAAATGAACCAAAGTCCAGTCTGC-3，；下游弓|物: 5'-GGAACACAGTGAACAGGAACTAAGG-3'；
Cre基因上游引物：O^TGGAATGGCTGGCTACTAT-GG^；下游弓|物：5，-TGCAATTGATCCCACAGGCA-3，,5，-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3，。反应体系为25□，反应程序：95C、3min,95C、33s,66C、33 s,72C、33s，共35个循环;72C、12min,4C、1h0配制2.0%的琼脂糖凝胶：称取2.5g琼脂糖粉末溶于106mt1xTAE电泳缓冲液中，微波炉中高火加热3min，冷却约2min后加入12以EB核酸染料，轻轻摇匀，避免产生气泡，制胶。取0^1PCR产物和3p,l DL2006bp DNA marker加入上样孔中进行电泳分析，恒压126V，时间45min；然后置于凝胶电泳成像仪中成像，观察电泳条带。若PCR条带出现与Anx基因、Cre基因PCR产物大小一致的条带则为阳性结果，即LamtoS"Zyz2-Cre"-。
1.2.4LamtorS基因敲除效果验证待小鼠成熟至8周龄，收集Lamtor2fl°x/fl°r Lyz2-Cre-/-小鼠和Lam-toST"Lyz2-Cre"-小鼠肺泡巨噬细胞，采用qRT-PCR方法检测两组LamtoS mRNA的表达。LamtoS 基因上游弓I物：5'-TTAATGAGGGATCGCTGCTGG-3下游引物：5'-CTACGGTCTCCTTGGCATACA-3；；内参GAPDH基因上游引物：0,-GTCAAGGC-CGAGAATGGGAA-3；下游弓|物：5，-CTCGTGGTTCA-CACCCATCAC；0
1.2.2小鼠肺泡巨噬细胞iNOS表达水平检测用RIPA裂解液提取Lamtor2fli/fl°r Lyz2-Cre---和Lam-toST”Lyz2-Cre"-小鼠肺泡巨噬细胞蛋白，吸取30以上清液与上样缓冲液混合后金属浴煮沸12 min变性，将所制蛋白样品进行SDS-CAGE电泳，恒压75V、122min；电泳结束后将蛋白转至经甲醇浸泡数分钟且适当大小的PVDF膜上，恒流222mA，冰上转膜】~2h后用0%脱脂奶粉室温封闭2h o 分别加入经Western blni一抗稀释液稀释的0-Actin 抗体（：000。）、LamCr2抗体（：】00。）和iNOS 抗体（:】000）,4C孵育过夜;1xTBST缓冲液洗膜3次，每次12min；加入5%脱脂奶粉稀释的山羊抗兔或山羊抗鼠的二抗（2:2000）孵育2h,x TBST缓冲液洗脱3次后化学发光成像系统进行拍照。观察Lamtore和iNOS的表达情况，进一步确定L amtor2.敲除后的杀菌活性效果0
1.2.2小鼠肺泡巨噬细胞内炎症因子表达水平检测收集繁殖子代中野生型小鼠的肺泡巨噬细胞作为对照组，而纯合子小鼠的肺泡巨噬细胞作为实验组，分别感染肺炎克雷伯标椎菌株（ATCC43816）（细菌：细胞=12:2，刺激6h后收集细胞，采用RT-qPCR方法检测两组细胞分泌的炎性因子肿瘤坏死因子（TNF）-a、白细胞介素（interlee kin,IL）-10和CxcH的mRNA相对表达量。
1.2.2小鼠Kp肺部感染小鼠处于麻醉状态下，鼻内注射】xl20CFU的Kp（ATCC43816）50门，观察小鼠的生存状况0
1.3统计学处理采用SPSS1
2.5软件进行统计学分析，每组实验重复3次，组间比较采用t检验。对于生存曲线比较，使用Log-rank（Mantel-Cox）test 分析结果,P<0.50为差异有统计学意义。
2结果
2.3小鼠繁殖及发育LamtoST自交后雌鼠2个月内生产幼鼠12只，幼鼠出生后由母鼠母乳喂养，新生小鼠无毛发，全身粉红；哺乳期约3周，存活12只，其中，LamtoST"2只，雄性。Lam-
toil +雄鼠与£y^2-Cre 雌鼠杂交后1月内生产幼
鼠共 8 只，其中 Lamtor2fiox/ + Ly2-Cre +/- 3 只。Lam-
雄性小鼠与 Lamtor2fio/ + Ly2-Cre +/"雌性小
鼠交配1个月内生产幼鼠共2只。
2.2小鼠基因型鉴定结果 取幼鼠脚趾组织进行PCR 扩增，r /基因型鉴定如图1所示。
噬细胞感染后iNOS 表达 提取两组小鼠肺泡巨噬 细胞蛋白进行Western blot 检测，结果如图4所示, 与 Lamtorl/10^0" Ly2-Cxe - 八小鼠比较，Lamtor2fli//li Lyz2-Cre +/_小鼠Lamtork 蛋白不表达，且Lam- tor2l1 Ly2-Cre +/-小鼠肺泡巨噬细胞在感染Kp 6 h 后,iNOS 表达减少。
2 000
1000750
500
250
100
bp M 1 2 3 4 5 bp
.O .5A 1.O.C
*艮浪友尖
1 2
图3 两组小鼠Lamtor2 mRNA 表达量
1 : Lamtor2^i/l -小鼠；
2 ： Lamtor2^i/l Lyz2-Cre +/ -
小鼠；与 Lamto2rfli Ly2-Cre + 八比较：…P < 2. 01
图1 %工基因型鉴定结果
M : Marker ； 1 : Lamtor —^^纯合子小鼠;2、3、4、5 : Lamtor —°x/ + 杂
合子小鼠
2 000
1000750
500
250
100
bp M 1 2 3 4 5 bp
700
350
图2 Cre 基因型鉴定结果
M : Marker 2 和 4 ： Lyz2-Cre +八；2、3、5 ： Lyz2-Cre _/ -
2.3 条件基因敲除小鼠肺泡巨噬细胞Lamtor2
mRNA 水平鉴定 分别提取10只实验组和10只
对照组小鼠肺泡巨噬细胞RNA，逆转录为cDNA , RT-c PCR 结果如图 3 所示，Lamtor2flr/fio/ Lyz2-
Cre +/_ 小鼠 Lamtor2 mRNA 的表达低于 Lcim- tor2^/flr Ly Z 2-Cre 「八小鼠:(2. 06 ± 2. 026) es (1. 22
±2. 003) ,P<0. 01］。2.4蛋白水平的Lamtor2基因敲除鉴定和肺泡巨图4两组小鼠肺泡巨噬细胞Lamtor2及感染后iNOS 蛋白表达
股市女神
1 : Lamtor2^i/l -小鼠；
2 ： Lamtor2^i/l Lyz2-Cre +/ -
小鼠
2.3 Lamtr2flrx/flrx Lyz2-Cre +八小鼠感染 Kp 后生
存状况观察 为了研究Lamtor2基因在Kp 感染中
发挥的作用，对照组和实验组分别取1只小鼠，通
过鼻滴法制作感染Kp 小鼠肺炎模型，监测小鼠7 d
病死率。Lamtor2flr/flr Ly^-Cre '7-小鼠组 7 d 病死
率为 3。％ ,Lamto2rfli Lyz2-Cre "-小鼠 7 d 病死率
为88% (中位生存时间=89.5 h,P =2.232 6)，差
异有统计学意义(图5)。
2.6 Kp 感染Lamtrr2条件性基因敲除小鼠的肺泡 巨噬细胞炎症因子的分泌水平选取Lamto2ror Lyz2-Cre "「小鼠的肺泡巨噬细胞为对照组，而Lam- tor2flr/l Lyz2-Cre"-小鼠的肺泡巨噬细胞为实验
组，分别感染Kp 后，实验组细胞内的炎性因子TNF-
= 17.54, P = 2.023 2)卫-10( =15.37, P =
2.024 2)和 C X cl1(i=37. 52,P=0. OH 7)的相对表
达量均低于对照组，差异均有统计学意义(图6)
。
-1- Lamtor 吵Lyz2-CrF
Lyz2-Crf王薄
00
(％)»忡酬5
0 5
7 5 20 -----------1-----------1-----------1-----------10 50 100 150 200
时间(h)
图6两组小鼠感染后7d 存活率
与 LamtoS flGK/flGK L yz2Ce --比较：P < 6. 55
L5 - 口 Lamtor^^^Lyzl-CrQ
辺 Lamtor^^^LyZl-Cr^'
0.0
TNF-a
.5
a *
IL-ip
Cxcll
图6两组小鼠肺泡巨噬细胞感染后炎症因子mRNA 表达
与 LamtoS flm/fir Ly2-Ce +/-比较P < 6. 52
3讨论
基因敲除技术是在22世纪88年代后半期根据 DNA 同源重组原理而发展起来的。它从分子水平
上去除或替代一个基因，整体水平观察实验动物，以
此检测被敲除基因功能的实验方法[8]o 有文献⑼
指出，基因敲除可能对小鼠的生殖功能有影响，但该
实验表明条件性基因敲除LamtoS 基因后并没有影 响小鼠的生育能力。利用Cre-Cnx 重组酶系统敲除
小鼠中LamtoS 基因，通过繁育和基因鉴定，成功筛
选出纯合子幼鼠(LamtoST" Ly2-Cre +/-)；繁殖
子代中的纯合子可用作实验组，野生型用作对照组。
当病原体侵入机体时，巨噬细胞的吞噬作用是
固有免疫应答的关键环节[16] ; LamtoS 调节着内 体-溶酶体系统，激活巨噬细胞MAPK 中的ERK 信
号通路，进一步激活NADPH 吞噬氧化酶的组装，使
吞噬体获得完整抗菌特性。它的缺失会影响NAD PH 吞噬氧化酶及诱导型一氧化氮合酶(iNOS )的活
化，从而抑制ROS 及NO 的产生，降低细胞感染病 原体时所发挥的抗菌活性72 o 在吞噬过程中，病原
体表面同源配体与细胞膜上受体的相互作用导致其
内化为噬菌体，需要与内体组分融合形成成熟吞噬
体，最终与溶酶体融合杀死微生物[I2-M]o 事实上, LamtoS 基因在吞噬体与溶酶体的融合过程中充当
重要角70 0 LamtoS 基因的缺失会导致晚期内体 (Rab2)在吞噬小泡上的分布和表达的急剧下降，使
得吞噬体-内泌体复合物向溶酶体的错误转运，杀
菌功能下降。该实验结果显示，条件基因敲除小鼠
对Kp 感染的抵抗能力减弱，病死率高。iNOS 的表
达随着LamtoS 基因的敲除而降低，说明MAPIK
ERK 信号通路杀菌效应受到了影响，而LamtoS 基
因对杀菌效应蛋白iNOS 的调控作用，可能也是宿 主抵抗Kp 感染的机制之一。此外，感染Kp 的Lam toS 条件敲除小鼠肺泡巨噬细胞中炎症因子TNF-
a 、IL-10和CxcH 的mRNA 相对表达量均降低，由
心游
此可见,LamtoS 促进了 Kp 感染巨噬细胞的杀菌过
不断深化对什么的认识
程。该研究成功构建的LamtoS 条件基因敲除小鼠
可以为后续研究LamtoS 基因在宿主抗感染的免疫
机制奠定了基础。
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Study on susceptibility of macrophage Lamtorl knockout
mice to Klebsiella pneumoriae
Su Conk1,Wu Tink2,Xu Fankmink2,e t
(1Depo of Irhectious Diseusrs,Thu Chaohu AffinateU Hospital ef Anhut Mebicai University,Chaohit238000;
1Depo r Ihuaoup Diseusrs,Thu Fti AffiliateU Hospital U Anhut Mebicai Uhsppy,Hput430424)
Abstrock Objective To stuuy tUe biolonicnh fukction of Lamtor2/eee ank P i mecCanism in tUe prccesc of Lam-tor2infection,the mone of Lamtor2macronpa/e conkitionee Ckocnoni mice infectee with KP was espn/shee. MbtOodi LamtoiO/10*mien were intronucee Us ceh-croscink,ank L,2-Cra mien were hyynaizeV wii Lam-to2a/*i ontaix oPspnIlk mid wii L(rntoiQ/La//loh Ly2-Crn_/-ank Lamtof.
小学生日常行为规范1*L,2-Cre*/_-The two/eeotyyes were hySriOizee i ontain cop W o I mid(Lamtor-0^00Ly2-Cre_/-)ank iamtor2conkitionaf Cnocnont mid(Lam-tor2flf/flf Lyz2-C a*/_).The toe/eomN DNA of min w/i e W p WV ank amp/Oee by polymeraso cnain reaction (PCR):The/eaotyyec of offsunn/mid were1X6-1106-by a/qr-4ei electronPoresic ank alveolqr mqcmppd/ec were extmcwU.The Lamtor2/eve Cnocnon-efect was0—0—by RT・qPCR ank Western blot.Min were infectef with Kp ank theO survPa[conkOioks were onserveU.The ex(ression/a/of TNF-c,IL-1p anO Cxc/dfter Kp in^Vcl tin with d/alar mqdoppd/ec were OetecteU by qRT-ACR in vitro,ank thebetweev the two/mnpc w/i performeU by-test.Western blo-was usef te yaify t he exxression/vat of iNOS.Resulto Lamtor2cenkitiona[ /eve Cnocnont monso monel wat successful/estaqlisUeU with viabir ank feni/oksurine.Compare-with coii W o I mid,apioati mid han/weo survOa[ra-e Kp infection•The/a/of TNF-q(-二17.54, 2.54±2.050,P二2.0232),ILA p(二15.37,2.35±2.243,P=2.5242),ank C xc11(-=37.32,2.53±2.243,P= 2.0027)from LamtofS0Ly2-C r e*z-monso alveolqr mqdoppd/ec reUucef,ank the iNOS expression Oe-
Coeclusior Lamtor2nnocOont mice are constrncteU,/O the survOa[ra-e of mice anO iNOS expression of«/1//'mqdoph/es Uecrevses/巩infecteO with Kp.
Key WOrOt Lamtor2；conkitional/eve Cnocnont-breeUinf；Klebsiella phumohar
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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