中国组织工程研究与临床康复第12卷第20期2008–05–13出版
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research May 13, 2008 Vol.12, No.20 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
3849 1Department of Dermatology, Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710004, Shaanxi Province, China; 2Medical Department, the 323 Hospital of Chinese PLA, Xi'an 710054, Shaanxi Province, China
Zhang Cai-qing☆，Studying for doctorate, Department of Dermatology, Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710004, Shaanxi Province, China zhangcaiqing1998@ yahoo
Received: 2008-01-11 Accepted: 2008-02-15 1西安交通大学第二附属医院皮肤科，陕西省西安市710004；2解放军第三二三医院医务处，陕西省西安市710054
张彩晴☆，女，1972年生，陕西省商南县人，汉族，西安交通大学第二附属医院皮肤科在读博士，主要从事皮肤病的临床医疗技能训练与研究。zhangcaiqing1998@ yahoo
中图分类号:R758.1
文献标识码:B
文章编号:1673-8225 (2008)20-03849-04
收稿日期：2008-01-11 修回日期：2008-02-15 (08-50-1-287/W〃Y)
张彩晴1，郭宏林2，冯捷1，闫小宁1，李文彬1，胡刚1
Effects of oxymatrine on expression of nuclear factor-kappa B and nitric oxide secretion in HaCat cells Zhang Cai-qing1, Guo Hong-lin2, Feng Jie1, Yan Xiao-ning1, Li Wen-bin1, Hu Gang1
Abstract
AIM: Substance P has a mutual regulative effect with the cytokines, and this study was designed to verify the effect of oxymatrine
and substance P on the protein and gene expression of nuclear factor-kappa B (NF-κB) as well as th
e nitric oxide (NO)'s secretion
of the HaCaT cells.
METHODS: The experiment was carried out in the Central Laboratory of Xi'an Jiaotong University from May to October in 2007.
HaCaT cell line was produced by ATCC Company; oxymatrine powder was offered by the Chinese Institute for Drug Control;
substance P was the produced of Alexis Company. The well-cultured HaCaT cells were divided into blank control group, three
oxymatrine groups pretreated with different concentrations (10, 50 and 100 mg/L) of oxymatrine, and substance P group. After
cultured for 24 hours, 10-5 mol/L substance P was added to the cells. Thirty minutes later, NF-κB P65 protein expressions were
evaluated by western-blot, and mRNA expressions were evaluated by reverse transcription polymerase chain reaction; NO level in
the supernatant of cell culture medium was also detected.
RESULTS: Compared with the blank control group, the expressions of P65 protein and mRNA of NF-κB enhanced , the secretions
of nitric oxide were obviously increased in the substance P group (P < 0.05). But the oxymatrine inhibited these phenomena in a
dose-dependent manner (P < 0.01).
CONCLUSION: Oxymatrine can down-regulate the expression of NF-κB of human keratinocyte HaCaT cell line and reduce the
release of NO, these effects show a dose dependence.
Zhang CQ, Guo HL, Feng J, Yan XN, Li WB, Hu G. Effects of oxymatrine on expression of nuclear factor-kappa B and nitric oxide丑小鸭变成白天鹅之后
secretion in HaCat cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20):3849-3852(China)
[lckf/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3849(ps).pdf]
摘要
目的：P物质与细胞因子之间存在互相调节的作用。实验拟验证氧化苦参碱、P物质对HaCaT细胞核转录因子κB蛋白和基 因表达及一氧化氮分泌量的影响。
方法：实验于2007-05/10在西安交通大学中心实验室完成。HaCat细胞株为ATCC公司产品；氧化苦参碱粉剂由中国药品
检验所提供；P物质为Alexis公司产品。选择生长良好的HaCat细胞用于实验，分为空白对照组，小、中、大剂量氧化苦参
碱组（分别加入10，50，100 mg/L氧化苦参碱）和P物质组。氧化苦参碱各剂量药物预处理24 h后加入10-5 mol/L的P物
质作用存量30 min。采用western-blot和反转录-聚合酶链反应法分别检测HaCaT细胞核转录因子κB蛋白和基因的表达情
况；并检测一氧化氮的含量。
结果：与空白对照组相比，P物质组细胞P65蛋白相对表达量、细胞核转录因子κB的mRNA相对表达量明显增高（P < 0.05），
与P物质组相比，氧化苦参碱组P65蛋白相对表达量、细胞核转录因子κB的mRNA相对表达量明显降低（P < 0.01）。P
物质组一氧化氮分泌量增加，氧化苦参碱组一氧化氮分泌量减少，并呈剂量依赖关系。
结论：氧化苦参碱可下调人角质细胞株HaCaT细胞核转录因子κB 的表达，并使一氧化氮的分泌量下降，且该效应呈剂量
依赖关系。刘欣揭孟晚舟案隐情
关键词：氧化苦参碱；HaCaT细胞；P物质；NF-κB；一氧化氮；组织构建
张彩晴，郭宏林，冯捷，闫小宁，李文彬，胡刚. 氧化苦参碱对HaCaT细胞核转录因子κB表达及一氧化氮分泌的影响[J].
中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3849-3852 [lckf/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3849(ps).pdf]
基础医学
张彩晴，等. 氧化苦参碱对HaCaT 细胞核转录因子κB 表达及一氧化氮分泌的影响
P .O. Box 1200, Shenyang 110004 *******************
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>>本文导读<<
0 引言
氧化苦参碱是我国传统中药苦参的提取物，它具有
抗炎、免疫调节作用，可用于湿疹、银屑病等皮肤病。P 物质是具有多种生物活性的神经肽，是神经系统和免疫系统共同的信使物质，参与皮肤免疫和炎症的调控过程[1-2]。核因子κB 是一种细胞核转录因子，在炎症和肿瘤性疾病中表达增强。神经肽与细胞因子之间也存在互相的调节作用[2]，而一氧化氮对于角质形成细胞在维持皮肤的正常生理功能中起着非常重要的作用，其失调与多种皮肤疾病发生、发展密切相关。有研究证实感觉神经肽P 物质对核因子κB 具有激活作用[3]
。为探讨氧化苦参碱、P 物质对HaCaT 细胞核因子κB 的表达及一氧化氮的分泌的影响，本文在这方面进行了初步探讨。
1 材料和方法
设计：以细胞为对象的对比观察实验。 单位：西安交通大学第二附属医院皮肤科。 材料：实验于2007-05/10于西安交通大学医学院生物实验中心实验室完成。HaCat 细胞株（ATCC 公司），P 物质（Alexis 公司），核转录因子κB P65兔抗人多克隆抗体(Santa Cruz 公司)，一氧化氮试剂盒(南京建成生物工程研究所)；氧化苦参碱粉剂（中国药品检验所）。
设计、实施、评估者：实验设计者、实施、评估者均为第一作者，已受过相关专业培训。
技术路线：
细胞培养：将HaCat 细胞用含体积分数为0.1的小牛血清DMEM 培养基培养，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO 2的饱和水汽二氧化碳培养箱。待细胞生长至融合，进行传代。选择生长旺盛、状态良好的细胞用于实验。
细胞分组：空白对照组、苦参碱小剂量（10 mg/L ）
组、中剂量（50 mg/L ）组和大剂量（100 mg/L ）组、P 物质组。
给药方法：将各剂量组加入对应浓度药物作用24 h
后，与P 物质组分别加入10-
5 mol/L 的P 物质作用30 min
后进行下列实验。
Western Blot ：取1×106细胞提取蛋白质，将蛋白质用SDS-PAGE 电泳，转NC 膜。10%脱脂奶粉的TBS 封固，结合一抗。TBS 漂洗。结合二抗。二氨基联苯胺显，Gel doc 1000凝胶成像系统进行密度扫描。结果用测得目标带的密度与β-肌动蛋白的密度比值表示（以A 值表示）。
反转录-聚合酶链反应：①按照试剂盒说明书提取总RNA 逆转录成cDNA 。②聚合酶链反应: 核转录因子κB 上游引物序列5’-GAC CAA CAA CAA CCC CTT C-3’，下游引物序5’-ACC TCA A TG TCC TCT TTC TGC-3’，扩增片断长度273 bp 。内参β-肌动蛋白引物序列：上游5’- A TC A TG TTT GAG ACC TTC A - 3’，下游5’- CA T CTC TTG CTC GAA GTC - 3’，扩增片断长度249 bp 。聚合酶链反应循环条件：94 ℃ 预变性 5 min ，94 ℃ 30 s, 51 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 30个循环后72 ℃ 延伸10 min 。聚合酶链反应产物检测：反应结束后取10 μL 反应物，琼脂糖凝胶电泳、照相。经凝胶分析软件(Bandscan 4.3)分析其密度值, 结果以目的基因产物与内参对照的密度比值表示（以A 值表示）。
一氧化氮水平的检测：收集细胞培养液，按一氧化氮试剂盒（酶法）说明书操作。将在波长530 nm 读取的标准管和测定管A 值按公式一氧化氮(μmol/L) = 测定管A/标准管A ×100 μmol/L ，计算一氧化氮释放量。
主要观察指标：①Western Blot 检测结果。②反转录-聚合酶链反应结果。③细胞上清液一氧化氮水平。
统计学方法：数据资料x _
±s 表示，由本文作者采用SPSS 12.0统计软件进行单因素方差分析，P < 0.05表示有统计学意义。
张彩晴，等. 氧化苦参碱对HaCaT 细胞核转录因子κB 表达及一氧化氮分泌的影响
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2 结果
2.1 Western Blot 检测结果 见图1，表1。
qq空间v8新版电泳结果表明，与空白对照组相比，P 物质组可见电泳条带明显增宽，核转录因子κB/βactin 密度比值较空白对照组升高（P < 0.05），说明P 物质可增加核转录因子κ B P65蛋白的表达。与P 物质组相比，氧化苦参碱组电泳条带变窄，密度比值明显降低( P < 0.01)，且呈剂量依赖关系关系。说明氧化苦参碱对P65蛋白表达具有明显抑制作用，且随药物浓度增大，抑制作用加强。
2.2 反转录-聚合酶链反应结果 见图2，表2。
与空白对照组相比较，P 物质组电泳条带增宽，亮度增加，条带密度值与β-肌动蛋白密度值的比值A 值升高，二者间有显著性差异(P < 0.05)，说明P 物质组核转录因子κB P65 mRNA 表达量增加。与P 物质组相比，各浓度氧化苦参碱组电泳条带变细，条带密度值与β-肌动蛋白的密度值比值A 值降低，二者间有显著性差异(P <
0.01)。说明氧化苦参碱对核转录因子κB P65 mRNA 表达具有明显抑制作用，且随药物浓度增大，mRNA 的表达量减少, 100 mg/L 氧化苦参碱组mRNA 相对表达量低于空白对照组(P < 0.01)。
2.3 细胞上清液一氧化氮水平 见表3。
空白组HaCaT 细胞分泌一定量的一氧化氮，而P 物质组细胞上清液一氧化氮的含量增加（P < 0.05）。氧化苦参碱组一氧化氮含量较P 物质组不同程度降低（P < 0.05）。
3 讨论
核转录因子κB 是一种细胞转录调控因子和原癌基因，在各种组织中均有表达[4]。但在许多炎症和肿瘤性疾病中表达增强，能调控多种炎症和免疫基因的表达[5]。核转录因子κB 主要由P50和P65 两亚基组成，在细胞静息状态下与其抑制因子ＩκB 结合，形成核转录因子κB ／ＩκB 复合体，使核转录因子κ B 以无活性的形式存在于细胞质中，一旦被胞外刺激信号刺激后与ＩκB 解离而转入核内调控基因表达[6-7]，是细胞启动的标志，并参与多种细胞活动[8]。多种刺激因素如病毒、细胞因子等均可导致其活化[9]。对于表皮角质形成细胞而言，核转录因子κB 的作用是双向的[10]。正常生理状态下，核转录因子κB 是表皮角质形成细胞维持正常功能的重要分子，通过适时准确的转录调控相关基因而保持表皮角质形成细胞的动态平衡；在病理状况下，在角质形成细胞恶性转化的初始阶段及恶性行为的维持过程中，均不可或缺[11-12]。核转录因子κB 同样也是角质形成细胞对各种
Figure 1 Protein expression of nuclear factor-kappa B (NF-κB)
P65 in each group 图1 各组核转录因子κB P65蛋白的表达
C P Y10 Y50 Y100
NF-κB 65 000 C: blank control; P: 10-5
mol/L substance P; Y10: 10 mg/L oxymatrine; Y50: 50 mg/L oxymatrine; Y100: 100 mg/L oxymatrine
电脑迷
甲基丙烯酸三氟乙酯β-actin 42 000
Figure 2 The mRNA expression of nuclear factor-kappa B in each
group
图2 各组核转录因子κB mRNA 的表达
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
2 000
1 000 750 500 250 100
1: marker; 2: blank control group; 3: substance P group; 4: 10 mg/L oxymatrine group; 5: 50 mg/L oxymatrine group; 6: 100 mg/L oxymatrine group; 7, 8, 9, 10, 11 are the internal control of 2, 3, 4, 5 and 6.
刺激因子诱发的应激反应的重要因子
种具有广泛生物学活性的自由基分子，由一氧化氮合酶催化产生。正常状态下，皮肤组织中的诱导型一氧化氮合酶在活性很低，一旦有炎症刺激(如细胞因子γ干扰素和肿瘤坏死因子α，脂多糖或UV等), 其会以一种非钙依赖方式被诱导表达生成比原生型一氧化氮合酶高100~1 000倍的一氧化氮，从而导致细胞不可逆转的氧化损伤等一系列病理变化。在角质形成细胞中，促炎性细胞因子和环境损伤因子，通过刺激细胞表达诱导型一氧化氮合酶，催化一氧化氮大量生成。越来越多的研究显示一氧化氮不仅调节炎性反应，而且也参与维护皮肤的自稳[14]，并双向调节角质形成细胞的凋亡，对许多皮肤疾病的发生发展产生重要影响[15]。一些瘙痒性皮肤病如特应性皮炎和银屑病患者皮肤中一氧化氮合成增加。皮肤组织细胞如角质形成细胞、肥大细胞和血管内皮细胞上都有一氧化氮合酶存在[16-17]，而P物质均可作用于这些细胞。
性反转
P物质是具有多种生物活性的神经肽，是神经系统和免疫系统共同的信使物质，通过与高亲和力的神经肽受体结合或直接启动细胞内的G-蛋白级联反应作用于皮肤细胞，调节皮肤免疫和炎症反应，在神经-内分泌-皮肤免疫系统网络中发挥重要作用。P 物质已被证实参与了皮肤免疫和炎症的调控过程[18-19]，如促进细胞增殖、诱导细胞分化、调节细胞因子等活性介质的释放等[1] ，在许多皮肤病的发病过程中起着重要作用。
氧化苦参碱作为一种抗炎免疫调节剂，已在临床上用于免疫性、过敏性皮肤病，具有激素样作用而无激素样副作用[20]，而其对角质形成细胞核因子κB表达和一氧化氮合成的影响尚未见报道，本文进行了初步研究。
本结果显示，空白对照组细胞核因子κB的蛋白和mRNA有一定表达，并分泌一定量的一氧化氮，说明核转录因子κB和一氧化氮在维持角质形成细胞的正常功能中有重要作用。而P物质组核转录因子κB蛋白和基因表达水平明显增高，一氧化氮的合成和分泌量增加，提示P物质可增强HaCaT细胞的核转录因子κB的蛋白和基因的表达，并可促进角质形成细胞合成分泌一氧化氮，说明神经肽在皮肤病的发病中与核转录因子κB和一氧化氮是相关的。而不同浓度的氧化苦参碱组细胞核转录因子κB蛋白和基因表达水平下降，一氧化氮合成分泌量明显下降，且随药物浓度加大而抑制作用加强，说明氧化苦参碱可能是通过下调核转录因子κB蛋白和基因的表达，减少一氧化氮合成分泌，发挥其抗炎、免κB蛋白和基因的相对表达量、一氧化氮分泌量也明显低于空白组，由此引发的问题是氧化苦参碱剂量过大是否引
起细胞功能和形态改变，尚需进一步研究。
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