和磷脂酰肌醇－３激酶的影响
凃 乾１ 叶 勇１＊ 杨丹丹２
十字军
（１．江汉大学医学院，湖北省武汉市经济技术开发区三角湖路８号，４３００５６；２．山东省乳山市人民医院）基金项目：科学技术部２００５年度国际科技合作重点项目计划资助项目（２００５ＤＦＡ３０８８０）
＊通讯作者：ｘｉｄａｎ＠１６３．ｎｅｔ，（０２７）８４２３０３９２
［摘 要］ 目的 探讨丹参酮Ⅱ
Ａ
促血管生成的作用机制。方法 将人脐静脉内皮细胞系（ＨＵＶ－ＥＣ－Ｃ）分为空白组、二甲基亚枫（ＤＭＳＯ，终浓度１％）组、血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ，终浓度５μｇ／Ｌ）组、丹参酮ⅡＡ（终浓度６ｍｇ／Ｌ）组，分别加入相应药物４８ｈ后，镜下观察各组细胞形态，并采用蛋白质印迹法测定各组细胞内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）、磷酯酰肌醇－３激酶 （ＰＩ３Ｋ）表达情况。结果 ＶＥＧＦ组和丹参酮Ⅱ
摆线Ａ
组ＨＵＶ－ＥＣ－Ｃ细胞形态饱满，丰度明显增加，细胞间隙缩小，均未见脱落。与空白组比较，ＶＥＧＦ组和丹参酮ⅡＡ组细胞ｅＮＯＳ、ＰＩ３Ｋ蛋白表达均显著增强（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０５）。结论 丹参酮ⅡＡ能提高ＨＵＶ－ＥＣ－Ｃ内ＰＩ３Ｋ和ｅＮＯＳ蛋白表达，可能是其促血管生成的作用机制之一。
［关键词］ 丹参酮Ⅱ
Ａ
；人脐静脉内皮细胞系；内皮型一氧化氮合酶；磷脂酰肌醇－３激酶
Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＴａｎｓｈｉｎｏｎｅⅡＡｏｎ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－Ｋｉｎａｓｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉ－ｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ
ＴＵ Ｑｉａｎ１，ＹＥ Ｙｏｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｄａｎｄａｎ２
生物医学工程与临床
（１．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｊｉａｎｇｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ４３００５６；２．Ｒｕｓｈａｎ Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＴａｎｓｈｉｎｏｎｅⅡＡ（ＴｓⅡＡ）ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ（ＨＵＶＥＣ－Ｃ）ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ｇｒｏｕｐ，ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ，ａ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １％）ｇｒｏｕｐ，ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ，ａ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ５μｇ／Ｌ）ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＴｓⅡＡ（ａ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ６ｍｇ／Ｌ）ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ４８ｈａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅ－ｓｐｏｎｄｉｎｇ ｄｒｕｇｓ ｗｅｒｅ ａｄｄｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｅＮＯＳ）ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗ
ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ＨＵＶＥＣ－Ｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ＶＥＧＦ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＴｓⅡＡｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｆｕｌｌｙ ｓｈａｐｅｄ ａｎｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｂｕｎｄａｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｎａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ｇａｐ ａｎｄ ｎｏ ｓｈｅｄｄｉｎｇ．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅＮＯＳ ａｎｄＰＩ３Ｋｉｎ ｔｈｅ ＶＥＧＦ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ＴｓⅡＡｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５ｏｒ Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＴｓⅡＡｃａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅＮＯＳ ａｎｄ ＰＩ３Ｋｉｎ ＨＵＶＥＣ－Ｃ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｂｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ ＩＩ－Ａ；ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ；ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅ
血管内皮细胞主要通过释放血管活性物质实现其功能，其中一氧化氮（ＮＯ）是最主要的活性物质，是对抗动脉粥样硬化发生的重要因子，它在一氧化氮合酶作用下，由左旋精氨酸氧化途径产生。其中，内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）主要存在于血管内皮细胞膜上，是合成ＮＯ的重要限速步骤
之一，其表达增加有利于冠状动脉侧支循环的生成。磷脂酰肌醇－３激酶（ＰＩ３Ｋ）／蛋白质丝氨酸－苏氨酸激酶（Ａｋｔ）是目前已知的影响血管生成的主要传导通路之一，ＮＯ促进血管生成的作用也是由ＰＩ３Ｋ介导的。本研究拟采用蛋白质印迹法探讨丹参中最具有代表性的脂溶性酮类成分丹参酮ⅡＡ对人脐静脉内皮细胞系（ＨＵＶ－ＥＣ－Ｃ）ｅＮＯＳ和ＰＩ３Ｋ表达的影响，以初步探讨丹参酮ⅡＡ对血管生成的作用机制。
１ 材料
１．１ 细胞株
ＨＵＶ－ＥＣ－Ｃ，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。
１．２ 药物与试剂
丹参酮ⅡＡ购自中国药品生物制品检定所，批号：１１０７６６－２００５１８；血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）购自美国Ｓｉｇｍａ公司；ＰＶＤＦ膜购自德国Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ公司，蛋白裂解液、苯（ＰＭＳＦ）和牛血清白蛋白（ＢＳＡ）购自Ｓｉｇｍａ公司，兔抗ｅＮＯＳ、兔抗ＰＩ３Ｋ和β－ａｃｔｉｎ抗体购自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司；羊抗兔ＩｇＧ抗体购自Ｊａｃｋｓｏｎ公
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·中医杂志２０１３年８月第５４卷第１６期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３，Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．１６
司，ＥＣＬ购自美国Ｐｉｅｒｃｅ公司。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，购自Ｇｉｂｃｏ公司，批号１１６１２３７；胎牛血清，购自Ｇｉｂｃｏ公司，批号２１６０７－０４５；胰蛋白酶，购自Ｓｉｇｍａ公司，批号３０２４１８；三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ），购自国药集团化学试剂有限公司，批号２００５０４１９；三（ＴＣＡ），购自国药集团化学试剂有限公司，批号８０１３２６２８；二甲基亚枫（ＤＭＳＯ），购自上海生工生物技术服务有限公司，批号：０４０６０２。
１．３ 主要仪器
二氧化碳培养箱（３１１０，Ｔｈｅｒｍｏ），超净工作台（ＢＣＮ－１３６０，哈尔滨东联电子技术开发有限公司），酶标仪（ＳｙｎｅｒｇｙＨＴ，Ｂｉｏ－ＴＥＫ），倒置显微镜（ＴＥ－２０００，Ｎｉｋｏｎ），电泳仪（垂直型，Ｂｉｏ－ｒａｄ）。
２ 方法
２．１ 细胞培养早熟禾属
党章ＨＵＶ－ＥＣ－Ｃ采用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基培养于３７℃、５％ＣＯ２培养箱，细胞生长至７０％～８０％融合传代，０．２５％胰酶消化细胞，细胞记数后按１∶３传代至６孔板培养，每孔２００μｌ，实验采用第１－４代细胞，鉴定内皮细胞纯度在９５％以上。
２．２ 分组及给药
细胞分为空白组、ＶＥＧＦ组、ＤＭＳＯ组、丹参酮ⅡＡ组，每组４个复孔，分别给药后培养４８ｈ，其中ＶＥＧＦ组ＶＥＧＦ终浓度为５μｇ／Ｌ，ＤＭＳＯ组ＤＭＳＯ终浓度为１％，丹参酮ⅡＡ组丹参酮ⅡＡ终浓度为６ｍｇ／Ｌ。
２．３ ＨＵＶ－ＥＣ－Ｃ形态学观察
各组细胞给药４８ｈ后，置于倒置显微镜下４０倍观察各组细胞形态、细胞间隙、细胞数量。
２．４ ｅＮＯＳ、ＰＩ３Ｋ表达
细胞给药４８ｈ后，收集细胞，蛋白裂解液裂解细胞，离心取上清液，－８０℃保存备用，Ｂｒａｄｆｏｒｄ法蛋白定量。配制分离胶（８％）和积层胶（４．５％）后上样；垂直电泳分离先稳压８０Ｖ３０ｍｉｎ，再调至１１０Ｖ６０ｍｉｎ；取凝胶电转至ＰＶＤＦ膜上。含５％脱脂奶粉的缓冲液封闭，加入一抗４℃孵育过夜，分别加入相应二抗室温封闭１ｈ。ＥＣＬ显曝光成像。以β－ａｃｔｉｎ为内参，进行半定量分析，蛋白相对表达量以目的蛋白与内参β－ａｃｔｉｎ电泳条带灰度值积分比值表示。２．５ 统计学方法
采用ＳＰＳＳ １７．０统计软件进行统计分析。计量数据用均数±标准差（珚ｘ±ｓ）表示，采用方差分析。３ 结果
３．１ 各组细胞形态学变化
空白组ＨＵＶ－ＥＣ－Ｃ呈梭形，铺路石样，细胞丰度约８０％；ＤＭＳＯ组细胞呈梭形，细胞丰度略小于空白组，细胞间隙增大，有少量脱落区域；ＶＥＧＦ组和丹参酮ⅡＡ组细胞形态饱满，丰度明显增加，细胞间隙缩小，均未见脱落。
３．２ 各组细胞ｅＮＯＳ、ＰＩ３Ｋ表达比较
表１示，与空白组比较，ＤＭＳＯ组ｅＮＯＳ、ＰＩ３Ｋ表达差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），ＶＥＧＦ组和丹参酮ⅡＡ组ｅＮＯＳ、ＰＩ３Ｋ表达均有显著增加（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５），ＶＥＧＦ组和丹参酮ⅡＡ组比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。
表１ 各组细胞ｅＮＯＳ、ＰＩ３Ｋ表达比较（珚
ｘ±ｓ）组别样本数ｅＮＯＳ ＰＩ３Ｋ
空白组４ ０．５２±０．３４ ０．４３±０．１８
ＤＭＳＯ组４ ０．５３±０．２９ ０．５７±０．３７
ＶＥＧＦ组４ １．９９±０．５６＊＊２．１６±０．５４＊＊
丹参酮ⅡＡ组４ １．５６±０．５７＊１．７７±０．６８＊
注：与空白组比较，＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１
４ 讨论
丹参为唇形科植物，属于活血化瘀类中药，具有活血调经、祛瘀止痛、养血安神等功效。现代医学研
究和临床实践表明，丹参有扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量、减慢心率等功效［１］。目前已有文献报道［２］，丹参注射液的含药血浆及血清具有促进鸡胚绒毛尿囊膜（ＣＡＭ）血管新生的作用。同时研究发现丹参酮ⅡＡ具有减轻过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）损伤、保护血管内皮细胞的作用［３］；丹参酮ⅡＡ能够改善血流速度及缺血－再灌注引起的微循环障碍，对缺血－再灌注引起的微循环障碍有一定的多靶点预防和作用；丹参酮ⅡＡ可以抑制由于血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）诱导的心肌细胞直径、心肌蛋白质合成速率及凋亡率的增加，降低凋亡基因Ｆａｓ ｍＲＮＡ的表达［４］；丹参酮ⅡＡ亦可上调心肌细胞凋亡蛋白ｂｃｌ－２、下调ｂａｘ蛋白及抑制ｐ５３蛋白的表达，可预防自发性高血压大鼠左室肥厚的形成［５］。我们推测丹参酮ⅡＡ可能具有促进血管新生的作用。血管生成或者退化取决于内皮细胞周围血管生成促进因子和抑制因子的动态平衡，血管内皮细胞分泌的ＮＯ能够显著地改善缺血和促进血管生成，并具有抗动脉粥样硬化作用。ｅＮＯＳ对ＮＯ的合成具有重要作用，ｅＮＯＳ的表达增加有利于冠状动脉侧枝血管的生成。本研究中，
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２０１３年第１６期凃乾等 丹参酮ⅡＡ对人脐静脉内皮细胞系一氧化氮合酶和磷脂酰肌醇－３激酶的影响
我们在蛋白水平上证实了丹参酮ⅡＡ能够上调ｅＮＯＳ的表达，由此可推测丹参可能通过上调ｅＮＯＳ表达，从而促进ＮＯ合成，以此发挥其促血管生成的效应。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ是目前已知的影响血管生成的主要传导通路之一，在血管生成过程中起着十分重要的作用，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路介导了ＶＥＧＦ的促内皮细胞
存活、迁移以及ｅＮＯＳ的激活［６－７］
，碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）
的促内皮细胞增殖作用也是由激活ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路而实现的［８］
。因此，
我们选择了ＰＩ３Ｋ通路以初步探讨丹参酮ⅡＡ通过ｅＮＯＳ－ＮＯ
途径促血管生成的上游信号转导机制，本研究证实其能够上调ＰＩ３Ｋ蛋白的表达，由此说明ＰＩ３Ｋ通路是丹参发挥促血管生成作用的途径之一。
血管生成是一个非常复杂的过程，尽管我们初步确定了丹参酮ⅡＡ具有一定的促血管生成作用，并初步探讨了其作用机制，但是要了解其详细的作用机制还需要做进一步的研究。参考文献
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０３４３．［７］Ｄｉｍｍｅｌｅｒ Ｓ，Ｄｅｒｎｂａｃｈ Ｅ，Ｚｅｉｈｅｒ ＡＭ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆ ｔｈｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙ
ｎｔｈａｓｅ ａｔ ｓｅｒ－１１７７ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＶＥＧＦ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２０００，４７７（３）：２５８－２
６２．［８］Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ，Ｌａｍｐｕｇｎａｎｉ ＭＧ，Ｍｏｏｎｓ Ｌ，ｅｔ ａ
ｌ．Ｔａｒｇｅ－ｔｅｄ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｒ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎｇｅｎｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｍｐ
ａｉｒｓ ＶＥＧＦ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｕｒｖｉｖａｌａｎｄ ａｎｇｉｏｇ
呼吸道病毒
ｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９９，９８（２）：１４７－１５７．（收稿日期：２０１２－０８－１０；修回日期：２０１３－０１－２０
）［编辑：洪 涛
］
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４１４１·中医杂志２０１３年第１６期
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