紫杉醇的研究进展
【摘要】：紫杉醇是存在于红豆杉树中的一种化学物质，其独特的抗癌疗效日益被人们重视，被誉为20世纪90etrust年代国际上的抗癌药三大成就之一。作为抗肿瘤药物应用于临床，特别是紫杉醇的化学结构与其药理活性的构效关系获得了重要成果。恶性肿瘤患者应用紫杉醇的临床资料,观察药物的毒副作用,总结紫杉醇临床应用特点。探讨紫杉醇的作用机理及其获得方法。
【关键词】：红豆杉 紫杉醇 抗癌 次生代谢产物 生物合成 机理
紫杉醇简介
紫杉醇最早由太平洋红豆杉Taxus brevifolia的树皮中分离提取的新型抗癌植物药，1992年12月29日，美国FDA批准紫杉醇上市，美国BMS公司，商品名Taxol，用于卵巢癌。紫杉醇的特点是广谱抗癌。对肺癌、食管癌、膀胱癌、头颈部癌、黑素瘤、结肠癌和HIV引起的卡波济肉瘤也有效【1】。
紫杉醇(Paclitaxel，商品名为Tax01)分子式为C47H5lNOl4，是1963年美国化学家Wall等首先
从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中分离出来的具有独特抗癌活性的二萜类化合物，命名为紫杉醇,1971年利用X射线确定了它的结构，紫杉醇为针状结晶，具有高度的亲脂性，不溶于水(在水中溶解度为0.006 mg／mL) ，不溶于石油醚，可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷等有机溶剂。与糖结合成苷后的水溶性大大提高，紫杉醇分子中虽有含氮取代基，但氮原子处于酰胺状态，邻近又有吸电子基，故不显碱性而为中性化合物。紫杉醇对酸相对稳定(pH4-8范围内)，碱性条件很快分解【9】。
紫杉醇在植物体内的含量相当低，目前公认含量最高的短叶红豆杉树皮中也仅含0．069％ ，资源很匮乏 。由于美国、加拿大等国家对红豆杉立法保护，药源地转向了中国等 国家。在中国，８０％的红豆杉集中在云南，而且云南红豆杉的紫杉醇含量 最高。从1992年到2001年，将近10年时间，云南红豆杉遭到了毁灭性的破坏，分布在滇西横断山区中的300多万棵红豆杉，绝大部分被剥了皮（有调查数据认为是92.5%），已慢慢死去。
紫杉醇作用机制
1979年SchiffP．B等才发现了紫杉醇的独特作用机理。微管主要成分是微管蛋白，分为a微管蛋白和13微管蛋白两种。a微管蛋白和13微管蛋白彼此间具有很强的亲和力，故常以二 聚体的形式存在，是构成微管的亚单位。在适宜的条件下，只要二聚体达到一定的浓度，就可以自我组装成微管。细胞中的微管装配所需要的微管蛋白来自细胞质中的微管蛋白库，而原有的微管解聚又是细胞质微管蛋白库中的微管蛋白二聚体的重要来源，可随时被用来装配纺锤体等微管【8】。紫杉醇能结合到肿瘤细胞的微管的特定部位上，防止细胞中原有的微管解聚，使微管稳定，细胞内积累大量的微管。这样，肿瘤细胞微管蛋白库中的微管蛋白二聚体含量达不到一定浓度，肿瘤细胞在有丝分裂时就不能由微管蛋白迅速重新装配形成纺锤体微管，抑制了细胞分裂和增殖，使癌细胞停止在G2和M期，直到死亡，从而阻止癌细胞的生长，进而起到抗癌的作用。即它可以直接作用于细胞微管，并与微管结合，使细胞微管稳定，并阻止其解聚，从而抑制纺锤丝和纺锤体的形成，使肿瘤细胞有丝分裂停【12】。 紫杉醇的抗癌活性源于他作用于细胞分裂过程中形成纺锤体的微管蛋白。微管是真核细胞的一种组成成分，它是由两条类似的多肽(a和β)亚单位构成的微管蛋白二聚体形成的，具有重要的功能，涉及有丝分裂时染体的运动、细胞形态的调整、激素的分泌、颗粒的转运、受体在细胞膜上的固定以及细胞的能动性。正常情况下，微管和微管蛋白二聚体之间
存在动态平衡。紫杉醇可使两者之间失去动态平衡，诱导和促进微管蛋白装配成微管，防止解聚，从而导致微管束的排列异常，形成星状体，使纺锤体失去正常功能，导致细胞死亡，紫杉醇可以在缺少三磷酸鸟苷(GTP)和微管相关蛋白(MAP)的条件下诱导形成无功能的微管，而且使微管不能解聚，从而发挥抗肿瘤药物。Manthey等发现紫杉醇与细菌性脂多糖(LPS)岁月的风铃>空手道男子一样，可激活鼠巨噬细胞杀灭肿瘤的作用【7】。此外，在正常鼠的巨噬细胞中γ-干扰素、LPS海外侨胞、或紫杉醇单用仅可诱导出低度或中度浓度的一氧化氮合成酶基因表达及一氧化氮分泌，然而紫杉醇或LPS与γ-干扰素合用则一氧化氮合成酶基因表达及一氧化氮分泌量均明显增加。一氧化氮分泌量与肿瘤细胞杀灭量呈正相关，并且紫杉醇在有一氧化氮合成酶竞争性抑制剂N6-甲基-L-精氨酸存在下，经紫杉醇抑制的巨噬细胞不能杀灭肿瘤靶细胞。所以，紫杉醇除有抗有丝分裂的作用外，尚有激活巨噬细胞介导的抗肿瘤作用。
紫杉醇生产
近年来，国内外在红豆杉人工栽培、紫杉醇化学半合成、红豆杉细胞培养、产紫杉醇内生真菌培养方面的研究取得了很大进展. 天然植物树皮提取抗癌药物紫杉醇：紫杉醇主要存在于太平洋紫杉树的内皮中，在干的内
皮中紫杉醇的含量仅为0．01％～0. 03％。提取IKg紫杉醇需要从2000～3000棵树上剥取9000Kg的内皮，而一名患者需要生长 100年的紫杉树5～ 6棵。太平洋紫杉是一种生长缓慢稀有的树种，利用它的树皮来生产紫杉醇会对生态环境造成严重破坏。因此，必须想办法从其他的途径得到紫杉醇【10】。研究发现，从幼树的针叶和树皮中也能提取紫杉醇，美国国立癌症研究所已经与一家公司合作实施大规模种植紫杉幼树的研究开发项目，使紫杉醇的来源困难有所改善。另外可用生物植株平种改良提高植物中药物含量——例如：红豆杉是东北红豆杉和欧洲红豆杉的天然杂交种，其枝叶中的紫杉醇量较高。曼地亚红豆杉是美国学者发现的一种天然杂交品种，其母本为东北红豆杉，父本为欧洲红豆杉。曼地亚红豆杉适应性强，生长速度快，不仅树皮中含有紫杉醇，而且枝叶中紫杉醇的量为0.017%~0.051%，甚至有高达0.069%的报道。
由于紫杉醇的量极低，且其提取中含有大量的植物蜡、素和树胶等杂质，特别是其中共存许多与紫杉醇分子结构和理化性质极其相近的紫杉烷系列化合物，给紫杉醇的分离纯化工作带来了很大的障碍。世界上通常的纯化方法都是将液液萃取、谱分离和重结晶等手段有机结合，并反复多次使用谱手段。从植物中提取紫杉醇的前期纯化来说，局部沉淀法是一个简单而有效地方法，该方法所用溶剂最少，但获得的紫杉醇的纯度和产量比较高。
紫杉醇化学半合成：许多化学工作者都在从事紫杉醇的全合成研究。其中2个研究小组己经取得成功。美国加州Scripps 研究所 Kyriacou Nicolaou重奖领导的小组用28步化学反应合成了紫杉醇，而佛罗里达州立大学 Rovert Holton领导的小组用40步化学反应合成了紫衫醇。
在经过大量调查和研究发现，云南和南方红豆杉中7．木糖．10一去乙酰紫杉醇(10一DAXT)含量极高，可达到植物干重的1‰以上。为能够将10一DAXT转化为紫杉醇，我们筛选了大量的木糖水解酶和具有相关活性的微生物，获得一株高产外分泌水解活性的菌株，该工艺使10一DAXT顺利转变成lO去乙酰紫杉醇(10．DAT)，后者经乙酰化顺利转变成紫杉醇。整个工艺共申请了12项专利，具有完整的知识产权，彻底解决资源紧缺的问题。半化学合成法不仅能得到紫杉醇而且能得到活性更高的紫杉醇类似物。欧洲紫杉的针叶是一种可以再生的资源，Mangatal东方女郎领导的小组利用从欧洲紫杉针叶中提取出的一种无生理活性的成分为原料，合成了紫杉醇及其类似物。这种用半合成活得到的紫杉醇已经在1994年用于临床试验。法国国家科学研究中心天然产物化学研究所的研究人员用半合成法得到的紫杉醇类似物taxatere（N-去苯甲酸-N三级丁氧谈基-10-去乙醇紫杉醇）的活性和水溶性均比紫杉醇好，这是一个很好的紫杉醇类似物【12】。
细胞工程培养紫杉醇【4】：红豆杉外植体的处理：用自来水充分洗净，再用70%乙醇冲洗表面后切成小块，在70%乙醇中浸泡2分钟，再转移至0.1%溶液中浸泡20分钟，然后用无菌水冲洗4到5次，备用。
愈伤组织诱导及培养：将上述无菌红豆杉嫩茎小块组织接种于含2ppm的2，4-D、0.5ppm的KT及10%椰乳的MS培养基中，于25摄氏度的二氧化碳培养箱中培养40天，PH5.8,即可形成小的愈伤组织块，然后每隔30天进行一次移植继代培养。每次移植继代培养均取一块愈伤组织，不另其混杂，如此多次移植继代培养即可获得多个愈伤组织无性系。细胞悬浮培养：培养基为含1ppm的2，4-D、0.05ppm的KT及10%椰乳的B-5培养基 。红豆杉细胞大量培养：培养基与悬浮细胞培养基相同。在反应器中加入培养液，灭菌后冷却至室温，接种已经培养30天的悬浮培养细胞，接种量按干细胞1到2克每升，在25摄氏度下，培养30天，待收获细胞。细胞干燥及收集：每批细胞培养30天后，离心或过滤收集细胞，用去离子水洗涤两到三次，每次抽干，然后于30至40摄氏度低温下真空冻干，即得红豆杉培养细胞成品。
紫杉醇内生真菌培养：1991年，美国蒙大拿州立大学植物病理学家Gary Strobel和化学家
安德里亚·斯带尔勒检验了从20多个样点的25棵大树上分离出的200多个微生物，结果有一种真具有合成紫杉醇的能力。把该菌放在合成培养基中培养，发现该菌合成紫杉醇能力十分稳定，经鉴定是一个新物种，他们把该菌命名为安德列亚菌。目前该菌合成紫杉醇的能力只有24—50ng／L。1996年，从西藏红豆杉小枝的内皮层中分离得到的内生小孢拟盘多毛孢，实验证明它能产生紫杉醇。 后来，人们发现从美国南卡罗来纳州柏树的树皮中获得的小孢拟盘多毛孢、一种土生茜草科植物中分离得到的内生真菌也能产生紫杉醇 。我国科研工作者在东北红豆杉、南方红豆杉、云南红豆杉中均到产紫杉醇的真菌 。但是这些菌株的产量实在太低。另据报道，我国西安一枝刘制药公司的研究人员从中国红豆杉树皮中分离出一种真菌，对其重组诱变，通过菌种优化培养，紫杉醇和BaccatinⅢ在培养液中的浓度均达到2×10。g／L，有望实现产业化。
最近的Nature，Science杂志分别报道了相关的研究成果来自美国麻省理工，新加坡等处的研究人员针对一种有效的抗癌药：紫杉醇，设计出了一种低廉获得紫杉醇的方法，这一研究成果公布在Science杂志上。紫杉醇的被称作紫杉二烯的关键性的前体可以通过发酵在大肠杆菌中大量地生产。这一工程学的壮举最终可能使人们到廉价有效的制造紫衫醇的方法。 主要是将从较为丰富的欧洲紫衫树或从培养的植物细胞中得到的一种有关的分子进行
化学转化而获取。 但是，这两种基于植物的加工过程非常困难而且费时，因此紫衫醇仍然很昂贵。了解及操纵紫衫醇的生物合成是对生物化学家和工程人员的一个持续的挑战。在这篇文章中，研究人员设计了在大肠杆菌中生产该化学产物紫杉二烯的紫衫醇生物合成通路中的两个最先的步骤。该方法通过平衡数种细菌和植物的酶来利用大肠杆菌的发酵过程。同期另外一篇相关的文章讨论了许多涉及紫衫醇设计过程中的因素以及开发产自植物的其它数种重要化学物质发酵过程的可能性的因素。
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