酶（enzyme）是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质，在细胞的各个部位都有酶的存在。人和动物体内的各种化学反应（包括新陈代谢反应）都必须由酶来催化，没有酶的存在，体内生物化学反应就无法进行。 组织及细胞中含有多种酶类，主要包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、ATP酶、非特异性酯酶、胆碱酯酶、琥珀酸脱氢酶、γ-谷氨酰转肽酶等。组织细胞内的各种酶均不具有使其本身直接可见性的特性，常需用某些方法在一定条件下将组织细胞中的酶作用于特定的底物，以底物分解产物作为反应物质，在原作用部位进行捕捉反应，从而使其具有可见性。这种通过酶的作用形成反应产物，经捕捉反应来显示细胞和组织结构中的各种酶，并对其进行定性、定位、定量的方法称为酶组织化学反应。 红账簿
酶组织化学技术在人类认识疾病的科学实践中曾非常活跃，50~60年代在病理学上的应用达到高峰。它所涉及的内容相当广泛，如利用酶组织化学方法研究生物体内细胞形态与其代谢、功能的关系；在病理学领域中，研究疾病发生、发展的代谢基础；肿瘤的诊断及鉴别诊断；肿瘤的代谢功能及形态与酶组织化学的变化规律；以多种酶组织化学指标显示细胞损害程度，从而检测新药物及其临床毒性等。但由于酶组织化学技术操作较复杂，需用新鲜组材料，且多数反应特异性不高，故其应用受到限制。同时因酶为蛋白质，它在福尔马林固定及石蜡包埋的组织中虽然失去了酶活性，但仍具有免疫原性，这使得应用较为特异的免疫组织化学方法显示酶成为可能，因而不少酶组织化学染现已被免疫组织化学技术所代替。但应指出的是，有一些酶组织化学方法仍以其良好的特异性在病理诊断及研究领域被广泛应用。目前最常应用于诊断的酶组织化学方法有骨骼肌相关酶（用于诊断肌病）、乙酰胆碱酯酶（用于诊断先天性巨结肠）、酯酶（用于辨认骨髓髓细胞系统的细胞和肥大细胞）以及酸性磷酸酶等染方法。
第一节酶组织化学反应的方法和基本原理
一、酶组织化学反应的主要方法和基本原理
1．金属沉淀反应法酶的分解产物可与大多数金属结合，金、银、铜、铁、
铅、钴及其化合物均具有颜，因此，在酶反应时使其与金属结合，利用其呈反应，显示出酶反应的部位，间接地证明某种酶的存在。该法主要用于显示磷酸酶，如显示碱性磷酸酶的钙钴法和显示酸性磷酸酶的硝酸铅法。
2．偶联偶氮法此法又称偶氮素法，其基本原理是使用某种人工合成底物，在酶作用下产生分解产物与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性偶氮素，以此对酶进行定位。常用的合成底物是萘酚系列化合物，其中萘酚AS 的衍生物应用效果良好，如萘酚AS-BI 、萘酚AS-D 、萘酚AS-TR 等。
重氮盐种类不同，其偶氮颜也有差异，可显示蓝、紫、红、褐、黑、棕等。重氮盐有程度不同的酶活性抑制作用，故必须选用抑制作用最弱者使用。偶氮素法有两种：①同时偶联法：酶在分解底物时生成无的初级反应物，后者立即与重氮盐偶联，生成有颜的偶氮素。②后偶联法：为了防止重氮盐对酶的抑制作用，先使酶与底物作用，产生分解产物沉着，然后再浸于重氮盐溶液中形成偶氮素。
同时偶联法的反应如下：
偶联法是
成都体育学院图书馆显示各种酶类最重要的方法，目前偶氮素法有了不少改进，已被广泛应用。
3．素形成法在酶作用下，使底物的无化学物质在作用的局部形成素沉着，从而达到显示酶定位的目的。常用的有：①四唑盐法：含有四唑盐或双四唑盐的底物混合液在脱氢酶的作用下，从底物分离出的氢离子与无的四唑盐或双四唑盐相结合，形成红或蓝的双甲潜素，该素沉着于酶作用部位，从而显示酶的存在部位。该法主要用于显示各种脱氢酶。②靛蓝形成法：又称吲哚酚法，是以酯型吲哚酚化合物为底物，酶作用于这些底物分解出吲哚酚，在氧存在的情况下生成蓝靛蓝，使酶所在部位显。
二、酶组织化学反应的影响因素
酶组织化学反应中酶的活性是至关重要的。因此，在制备标本及组化实验中必须做到既要最大限度地保存酶的活性，又要保存好组织细胞的形态结构，
以保
底物、重氮盐同时在孵育液内PRP —初级反应产物
FRP —最终反应产物
证酶在组织细胞中的准确定位。许多因素可以影响酶的活性：
1．温度酶反应的最适温度为37℃。温度较低时酶反应速度减慢；而温度增高虽可使酶反应速度加快，但温度超过60℃时，大部分酶会因蛋白变性而丧失活性。
湖南卫视 百科全说2．pH值各种酶均有其适宜的pH值范围，在此范围内酶的活性最强，所催化的酶反应速度最大。大部分酶的适宜pH在7.0左右，强酸和强碱均使酶失活。
3．激活剂和抑制剂能使酶活性增强的物质称为激活剂（activator），而使酶活性降低的物质称为抑制剂（inhibitor），多为一些金属离子或氧化还原剂等，如镁离子为碱性磷酸酶的激活剂，钙离子则为酯酶的激活剂。胆碱酯酶的特异抑制剂为四异丙基焦磷酸胺，丙二酸钠则可抑制琥珀酸脱氢酶的活性。
其他如固定剂、脱水剂等有机溶剂对酶的活性也有影响。
鉴于酶的上述特点，因此，进行酶组织化学染时必须注意：
1．大多数酶反应要求使用新鲜组织冷冻切片，少数可用低温石蜡切片，以保存酶活性。
2．试剂配制所用器皿必须清洁，以防污染及出现假阳性。所配制试剂的浓度必须准确，底物称量要准确，最好用双蒸水。所用的试剂必须是分析纯（AR），并对所检测的物质或酶反应无影响。
3．孵育液的pH值必须准确，以保证酶反应在其最适宜的pH值范围内进行。
4．酶反应的温度和时间必须控制好，以保证酶的最大活性及充分的酶反应环境。
5．必须设立阳性或阴性对照，阴性对照可采用去除底物、加热、或加特异性抑制剂等。
第二节常用的酶组织化学染方法及其应用
－、碱性磷酸酶显示法
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP），又称碱性磷酸单酯酶（EC3．1．3．1）。该酶在碱性环境下催化水解磷酸单酯生成磷酸和醇，最适pH为9.2~9.4，可被Mg2+、Mn2+和某些氨基酸所激活；、碘液、砷酸盐等可抑制其活性。
碱性磷酸酶分布广泛，多见于有活跃转运功能的细胞膜内，如小动脉和毛细血管的内皮细胞、肝毛细
胆管膜、肾近曲小管刷毛缘及小肠上皮纹状缘等。骨的Ewing肉瘤此酶呈强阳性；急性单核细胞白血病、套细胞淋巴瘤、成骨肉瘤、滑膜肉瘤、类白血病反应等均呈阳性反应。
显示AKP的方法很多，主要有钙钴法和同时偶联法。前者所需试剂便宜，容易购买，操作简单，但会出现假阳性。后者方法较灵敏，而且在正常组织内不存在萘酚，因此不会出现假阳性，但所需试剂较难购买。
G o mori改良钙钴法
在pH9.2~9.4情况下，碱性磷酸酶作用于β-甘油磷酸钠生成磷酸基，磷酸基与Ca2+结合形成磷酸钙，将磷酸钙转变成磷酸钴，再使磷酸钴转变成黑的硫化钴。
【试剂配制】
碱性磷酸酶孵育液3%β-甘油磷酸钠10ml，2%钠10ml，2%无水氯化钙20ml，2%硫酸镁lml，蒸馏水5ml，pH9.2~9.4
2%硝酸钴水溶液硝酸钴2g，蒸馏水加至100ml
1%硫化铵水溶液硫化铵1ml，蒸馏水99ml
【染步骤】
1．新鲜组织恒冷箱冷冻切片4~6µm。
2．碱性磷酸酶孵育液作用切片10min，37℃。
3．蒸馏水洗2~3次，1min/次。
4．2%硝酸钴水溶液作用5min。
5．蒸馏水洗2~3次，1min/次。
6．l%硫化铵水溶液（现配用）1min。
7．蒸馏水冲洗后甘油明胶封固。
【结果】碱性磷酸酶活性部位呈棕黑。
【注意事项】
1．新鲜组织冷冻切片后可用10%中性福尔马林轻固定10min，然后进行孵育反应。反垃圾邮件系统
2．阴性对照可去除底物或用Lugol碘液3min或左旋咪唑抑制剂处理。
3．该酶能耐受固定，可用于石蜡切片，孵育时间适当延长。
二、酸性磷酸酶显示法
酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP），又称酸性磷酸单酯酶（EC．3．1．3．2）。该酶在酸性环境下催化水解磷酸单酯生成磷酸和醇，最适pH为4.8~5.2。抑制剂因组织差异而不同，前列腺来源者被酒石酸和氟化物抑制，但不被0.5%甲醛液抑制；红细胞来源者被甲醛液、氟化物轻抑制，但不被酒石酸抑制；而肝源性者以上三种抑制剂均可抑制之。
酸性磷酸酶分布广泛，主要位于溶酶体内，是溶酶体的标志酶，正常组织以前列腺含量最高，吞噬细胞内含量也很丰富。此外，肝、肾、肾上腺及空肠上皮刷状缘等部位均有该酶存在。在组织退变、核酸和蛋白质代谢活动增加时，酸性磷酸酶的活性增强。前列腺癌该酶呈强阳性；霍奇金淋巴瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌和表皮样癌亦为强阳性。
显示ACP的方法很多，主要有硝酸铅法和同时偶联法。
tutt改良偶氮素法
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Leder-S-S-Stutt
【试剂配制】
l．副品红盐酸液副品红1g，2mol/L盐酸25ml，混合摇震完全溶解，2天后过滤，4℃保存。
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2．4%亚硝酸钠水溶液亚硝酸钠4g，蒸馏水96ml。临用前配制。
3．醋酸盐缓冲液pH7.6。
4．六偶氮副品红液1液6滴，2液lml（慢慢滴入不断摇动），静置2min 使其充分偶氮化，再加入3液30ml，最后用2N HCI调pH值至5.0~5.1。
5．AS-TR磷酸酯液萘酚AS-TR磷酸酯或萘酚AS-BI磷酸酯10mg，二甲基甲酰胺lml，摇动使其充分溶解。
6．孵育液萘酚AS-TR磷酸酯液lml，六偶氮副品红液30ml。
陕西电视台【染步骤】
l．新鲜组织恒冷箱切片4~6µm，冷风吹干后入冷丙酮固定10min。
2．切片入孵育液于37℃恒温箱内孵育30~90min。
3．流水冲洗后可用苏木精或2%甲基绿染核。
4．流水冲洗后脱水、透明、树胶封固。
【结果】酸性磷酸酶活性部位呈红，核呈蓝或绿（彩图2-1）。
【对照】80~90℃热水处理10min，或孵育液加0.01mol/L氟化钠，结果为阴性。
三、三磷酸腺苷酶显示法
三磷酸腺苷酶（adenosin triphosphatase,ATP）又称ATP磷酸水解酶，它水解底物三磷酸腺苷生成二磷酸腺苷和磷酸，同时产生能量。甲醛对其有抑制灭活作用，故不宜用甲醛固定。根据ATP酶对激活剂和抑制剂的反应以及酶定位的不同，主要分三类：
1．膜ATP酶又称Na+/K+激活ATP酶，可被Na+、K+和Mg2+激活，最适pH值为7.2～7.5，抑制剂为Ca2+和苦毒毛旋花子苷等。该酶常存在于细胞膜，特别是分泌功能活跃的细胞膜如肝毛细胆管、肾近曲小管刷状缘等，为参与主动转运的离子泵的重要成分。
2．肌球蛋白ATP酶可被Ca2+激活，被Mg2+抑制，最适pH值为9.0。此酶定位骨骼肌丝上，其功能是分解ATP，为肌细胞收缩供能。根据其活性高低可将骨骼肌分为I型肌（又称红肌，酶活性高）和II型肌（又称白肌，酶活性低）。
3．线粒体ATP酶为Mg2+激活的ATP酶。此酶在心肌最丰富，肝脏次之。心肌细胞线粒体ATP酶由Mg2+激活，Ca2+抑制，肝细胞线粒体ATP酶由Mg2+和Ca2+同时激活。抑制剂为对-氯汞苯甲酸和氟化物。
酶组织化学技术对肌肉活检标本的病理诊断是极其必要的：在不同的pH孵育下显示ATP酶可以识别I型与II型肌纤维，其分布方式与数量的变化在诊断神经性疾病、肌源性营养不良及强直性营养不良具有重要作用。此外，为了评价肌纤维的健康状况，可用琥珀酸脱氢酶作为标志酶检查线粒体功能。有时肌肉酶组织化学在评价内分泌性肌病具有一定作用。如在Cushing综合征等及外源性皮质激素过多时，可出现选择性II型纤维萎缩。溶酶体的酶组织化学在炎性肌病的诊断中也有帮助。
（一）Wachstein-Meisel镁激活酶法
该法对毛细胆管的显示特别清楚，所以主要用于观察肝细胞的受损情况。
【试剂配制】
孵育液三磷酸腺苷二钠盐10mg，0.2mol／L Tris-HCl buffer（pH7.2）10ml，
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