生物资源2021,43(1 ):94〜99
Biotic Resources
DOI： 10. 14188/j. ajsh. 2021. 01.013
李露+，韩雪影+
(青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东青岛266042)
摘要：衣康酸（itaconic acid, IA)是一种白结晶状的不饱和二元羧酸，它是化学和制药工业中许多相关化合物的前体. 被广泛应用于树脂、塑料，胶乳和超吸附剂等的T业生产中与化学法生产衣康酸相比，生物法具有原料来源广泛，生产过程 能耗低，不污染环境等优点。介绍了衣康酸合成的生物代谢途径，以及在野生型宿主和异源宿主中生产衣康酸和提高衣康酸产量的生物技术，为今后开展利用生物技术生产衣康酸的研究提供参考 关键词：衣康酸；生物合成；代谢工程
中图分类号：Q819 文献标志码：A 文章编号：2096-3491(2021)01-0094-06
Research progress of metabolic engineering breeding to improve itaconic acid
production
LI Lu , HAN Xueying
(College of Mairine Science and Biological Engineering, Qingdao University of Science 8^ Technology, Qingdao 266042，
Shandong, China)
A b s tra c t：Itaconic acid (I A), also known as methylene succinic acid, is a white crystalline unsaturated dicarboxylic acid. It is the precursor of many related compounds in the chemical and pharmaceutical industries, and widely used in the industrial production of resins, plastics, latexes and superabsorbents. Compared with chemical production of itaconic acid, biotechnology has the advantages of a wide range of raw materials, low energy consumption in the production pr〇- c e S w S, and no environmental pollution. In order to provide a reference for future research on itaconic acid production by biotechnology, the biometabolic pathway of itaconic acid synthesis is introduced, and the biotechnologies to produce itaconic acid in wild-type hosts and heterologous hosts and increase the production of itaconic acid are reviewed.
Key words：itaconic acid；biosynthesis；metabolic engineering
〇引言
衣康酸又称甲叉琥珀酸、亚甲基丁二酸，其化学 结构中含有一个不饱和双键和两个竣基，使其具有 活泼的化学性质，通过反应可以转化为高价值的生物基化学品，能够取代基于石油化学的丙烯酸和甲基丙烯酸合成乳胶、不饱和树脂和清洁剂等，2004 年被美国能源部评选为12种最具发展潜力的生物基平台化合物之一"。目前衣康酸的生产方法有化 学法和生物法，与化学法生产衣康酸相比，生物法具 有生产成本低、生产效率高、工艺技术成熟、环保节 能等优点，因此生物法是丁.业生产衣康酸中最常用 的方法。生产衣康酸的微生物众多，可分为天然生 产和非天然生产衣康酸微生物.天然生产衣康酸的微生物有土曲霉d/)e<r^7+//w.v k m w)、黑粉菌（t/.W-非天然生产衣康酸的微生物必须表达外源基
收稿日期：2020-10-15 修回日期：2020-11-24 接受日期：2020-12-15
作者简介：李露（1976-)，女，博十，教授，主要从事生物质化丨：方面的研究，E-mail:zhangU丨1!@126.<:〇111：韩雪影（1997->，女，硕士生，主要从事 大肠杆菌生产衣康酸的研究，E-mail:**********************。十李露、韩司■影对本文有同等贡献，为共同第一作者
引用格式：李露，韩雪影.提高衣康酸产量的代谢工程育种研究进展[J].生物资源，2021, 43(1): 94-99.
Li L, Han X Y. Research progress of metabolic engineering breeding to improve itaconic acid production [J]. Biotic Resources, 2021, 43(1)：94-99.
生物资源• 95 •
因C M (编码顺乌头酸脱羧酶）才能生产衣康酸，目 前经过改造后能够产衣康酸的微生物有黑曲霉(A .s - pergf /Z M i ' w /ger ) 、 酵母菌 （ yeast ) 、 大 肠杆菌 （ n _c /n'a co /z +)和谷氨酸棒状杆菌（CorjwehcYmhw 如；7»'〇/;^)等[21。本文对不同微生物生产衣康酸的研 究进展进行梳理，总结现有研究的不足，展望未来研 究的方向。
1衣康酸的生物合成途径
土曲霉和黑粉菌是天然生产衣康酸的微生物，
这两种微生物中衣康酸的合成途径有所不同。如图 1所示，两种途径中衣康酸的合成都以三羧酸循环 为依托，以胞质顺乌头酸（cis -A C O )为底物，线粒体 中的顺乌头酸由线粒体转运蛋白（M «A 基因表达） 运输至细胞溶质中。在土曲霉中顺乌头酸由顺乌头 酸脱竣酶（C a J 基因表达）催化生成衣康酸，衣康酸 为分泌型产物，通过质膜转运蛋白（M /s A 基因表达） 被运输至胞外。在黑粉菌中，顺乌头酸在胞质乌头 酸异构酶基因表达）的作用下转化为反式乌 头酸，然后经反式乌头酸脱竣酶（r «心基因表达）催 化合成衣康酸，最后通过质膜转运蛋内U /p i 基因表 达）分泌至胞外[3]。 葡萄糖 衣康酸
葡萄糖 M t'sA
I
丙酮酸
-柠檬酸
| Cad
►顺乌头酸—衣康酸
Adil|
反式乌头酸
Tadlj
衣康酸
ltpl __________
衣康酸
图1
方泰胶辊有限公司
衣康酸的生物合成途径
Fig. 1 Biosynthetic pathway of itaconic acid
苹果酸(
延胡索酸l
琥珀酸
线粒体|\
乙_辅酶A ―草酰乙酸^
柠檬酸—
、M ttA
顺乌头酸_酣‘酸'
：酸-
细胞溶质
2产衣康酸野生型菌株
2.1 土曲霉生产衣康酸
土曲霉是最早应用于衣康酸工业生产的微生 物，具有天然高产的优点。由于发现和应用都较早， 对于土曲霉产衣康酸的研究已经比较全面、系统。
从培养基成分、发酵条件的优化，诱变处理土曲霉获 得高产衣康酸菌株，构建工程菌改善土曲霉内部合 成通路等各个角度吸引了众多研究者。2.1. 1 发酵条件
实验表明，持续的氧气供应是必需的，适度加强 搅拌和増加曝气气体中的氧气浓度可提高衣康酸 的
产量，剧烈搅拌会对菌丝体造成损伤[4]。发酵中 p H 值变化也会影响衣康酸的生产，研究者测试了 3.0〜3. 6之间的p H 值对衣康酸生产的影响，发现 当p H 值控制在3. 4时衣康酸产量最高[5]。培养基 中的某些微量元素对衣康酸的生产有抑制作用，比 如锰离子浓度小于3X l (T 9mol /L 是衣康酸高产的 基础[5]。
2. 1.2诱变处理
通过诱变筛选高产衣康酸的菌株是提高衣康 酸产量有效且简便的方法之一。用亚硝基胍 (N T G )处理土曲霉IF 06365后，采用衣康酸浓度 梯度琼脂平板技术筛选，成功得到突变菌株T N - 484，在2.5 L 的生物反应器中发酵获得82.3 g/L 衣康酸m 。采用原生质体硫酸二乙酯诱变技术对 土曲霉C IC C 2433进行两次诱变，衣康酸产量较原 始菌株提高了 167.98%[8]。L iC l 和U V 诱变是常用 的菌株诱变方法，对土曲霉进行L iC l 和U V 复合诱 变，通过筛选均获得了比出发菌株产量更高的 菌株
2. 1.3利用不同发酵底物生产衣康酸
土曲霉发酵原料以葡萄糖为主，由于土曲霉缺 乏分泌糖化酶的能力，所以不能直接利用淀粉等
大分子碳水化合物，对淀粉等大分子碳水化合物 进行预处理后，才能成为衣康酸生产原料。近年 来为了贯彻环保、节能理念，同时为了降低衣康酸 的生产成本，许多研究者以廉价淀粉、农业残余、
林业残余等作为原料生产衣康酸。如：以小麦糠 为二代原料，对其进行碱性预处理和酶水解得到 混合糖液，以此为碳源进行发酵生产衣康酸，得到 27. 7 g /L 的衣康酸[11]。以稻草秸秆酶解糖化液为 原料，利用土曲霉K Y -013发酵生产衣康酸，在不 额外添加葡萄糖和木糖条件下，衣康酸产量可达 到 9.78g /L [12]〇
2.2 黑粉菌生产衣康酸
除了土曲霉外，黑粉菌也能够天然生产衣康酸， 与土曲霉相比，黑粉菌具有较高的pH 耐受性，但容 易丝状生长，影响发酵过程中搅拌和氧气通量。研 究者以玉米黑粉菌（[/边'/ago
M B 215作为
发酵菌株，使用200 g /L 葡萄糖和75 m M 铵盐发酵产
•96 •李露等：提高衣康酸产量的代谢T程育种研究进展
生了 44. 5 g/L衣康酸，最大生产速率为0. 74 g/L/h[131。从126种香根草黑穗菌（wA'w n'ae)菌株中 筛选出衣康酸产率最高并具有较高的甘油摄取率的 菌株T Z1，并以甘油作为原料进行生产衣康酸，获得 了37.2g/L的衣康酸产量[141。
3工程菌株构建
3.1土曲霉工程育种生产衣康酸
通过在土曲霉中表达外源基因使代谢通路中衣康酸的前体物质积累，可增加衣康酸的产量。
C a J和A</L4两种基因的过表达有利于衣康酸产量的提高，T EG_W954,ACA/和C7T A基因在土曲霉中过表达时，衣康酸产量均比原菌株低，表明这些基因的过表达不利于土曲霉中衣康酸产量的提高115]。研究者将g/a A基因（编码葡萄糖淀粉酶）转 人土曲霉C ICC40205，得到直接从液化淀粉生产衣康酸的土曲霉菌株，发酵获得了 77. 6 g/L衣 康酸[161。
3.2黑粉菌工程育种生产衣康酸
研究者敲除使黑粉菌丝状生长的和
这三个基因，使其形态与酵母菌相像，消除了发 酵中的剪切力，使其形态更有利于发酵生产™。删 除玉米黑粉菌中催化衣康酸生成副产物的基因
C_y/?3，同时过表达基因簇调节子r/u i，可将衣康酸产 量提高至（63.2±0.7)g/L™。通过缺失衣康酸氧化酶和过量表达限速生产步骤来优化衣康酸生产，利用狗牙根黑穗菌（{7边'/叹〇rjwodow/z'i')A/«W A /V尸…a,n d菌种发酵产量可达（82.9土0.8) g/L19]。对玉米黑粉菌菌株MB215做/«z7基 因缺失处理，使菌株形态得到改善，并用CaCO，原位 产物结晶，最终衣康酸产量高达220 g/L[2°]。
3.3黑曲霉工程育种生产衣康酸
文献中报道的土曲霉生产衣康酸的产量在大多 数情况下明显低于黑曲霉生产柠檬酸的产量。而柠 檬酸又是衣康酸生物合成途径中重要的前体物质之 一，柠檬酸的过量表达是衣康酸高产的基础，虽然黑 曲霉不是衣康酸的天然生产者，但黑曲霉具有生产衣康酸的天然优势。外源基因Cat/(编码顺乌头酸脱羧酶）在黑曲霉中的表达，完善了黑曲霉中衣康酸 的生物合成途径。将C ac/基因转化至黑曲霉中进行 外源表达，发现其生产水平较低，之后研究者将C^、M«A与M_/S A这三个基因共同在黑曲霉中过度表达，衣康酸产量大幅度提高[21]。以黑曲霉A B L作为宿主，构建工程菌株A B J.C W+
M/vA+M«A，并将胞质柠檬酸合成酶基因C/出在A B L U C W+M/M+M?M菌株中过表达，通过分 批发酵实现了高达26. 2 g/L的衣康酸产量，且减少 了副产物柠檬酸的生成以工业柠檬酸生产菌株Y X-1217为宿主，将A O V基因（编码顺乌头酸酶）和C a d基因构建在同一个表达载体中，与仅表 达C似/的菌株相比，衣康酸产量增加了 71.4%[23]。通过过表达编码A T P柠檬酸裂解酶的基因增
加溶质中的乙酰辅酶A含量，可增加衣康酸的产量 至 42.7g/L[24]。
3.4 酵母工程育种生产衣康酸
酵母在工业发酵中具有许多优势，包括在低pH 值和低温下也能旺盛生长，对剪切应力的高度耐受性，
极少发生噬菌体污染以及易于分离等，这些优势 可用于衣康酸的生产中。将Cat/基因转化进酿酒酵 母（SaccAarowj/ces cem；扮a«〇B Y4741 中，成功获得生产衣康酸的酿酒酵母，最高产量为59mg/mL[25]。通过计算机指导依次敲除了知a2和t o〗这三 个基因，将衣康酸产量提高至168 mg/L。Cat/基因 也已被引人产油酵母解脂耶氏酵母（yarrowz'a/中〇-/声Va)中，将M rM基因和Cat/基因在耶氏解脂酵母 中共同表达.通过发酵优化，工程耶氏解脂酵母的衣 康酸产量达到22. 03 g/L26•，此值为迄今报道的使用 限定培养基在自然低pH条件下酵母获得的最高发酵衣康酸含量。毕赤酵母（PzV/u'a知)是一 种非常规酵母，对低pH值的有机酸具有很高的耐受 性。将C a J基因和M/M基因转人毕赤酵母，并敲除 了两个编码异柠檬酸脱氢酶的基因，但获得的衣康 酸产量略低[271。
3.5 大肠杆菌工程育种生产衣康酸
大肠杆菌作为底盘细胞具有自身的优势：细胞 生长周期短，最终时空产率高；遗传背景清楚，基因 改造较为容易，具有很好的有机酸耐受性，具备生产 较高浓度衣康酸的潜力。采用基于模型的方法，以一种新的迭代方式优化大肠杆菌的衣康酸生产，构 建出工程大肠杆菌（AAyAA A
J J5 pCadC S)，获得衣康酸的最高浓度为32 g/L[281。对C M基因进行密码子优化，在大 肠杆菌中表达得以实现衣康酸的生产，但产量低于 10 mg/L[29]。将 C M C7V、/>■( pEp(磷酸烯醇式丙 酮酸）竣化酶）在大肠杆菌中过表达，同时将基
因敲除阻断乙醛酸分流途径，以木糖和甘油为碳源，通过分批补料发酵，获得衣康酸产量为43 g/L，最终收率为每克甘油0.6 g衣康酸|3°]。以柠檬酸为 原料，通过过表达A C iV和C W基因，构建大肠杆菌
生物资源.97.
全细胞生物催化剂，将柠檬酸转化为衣康酸％，结 果表明增加C a J的拷贝数能够提高柠檬酸向衣康
酸的转化率，包含和三个Cat/基因的大肠杆菌柠檬酸的转化率可达到64.0%。利用酶的自组装技术，将衣康酸通路中三个关键的基因ACA/、<!W、g&4通过配对的蛋白质支架融合在一起，使这 些蛋白酶彼此靠近，形成相应底物产物通道，比无蛋 白质支架的衣康酸的产量高出3.8倍[32]。由于大肠 杆菌是兼性厌氧微生物，因此在厌氧的条件下也可 以进行发酵生产衣康酸。在磷酸乙酰转移酶(P T A)和乳酸脱氢酶（从M)缺陷型大肠杆菌菌株BW25113(D E3)中过表达基因C a i g/M j C A/，发 酵得到的衣康酸浓度为2.9 mM[33]，这是首次利用厌氧发酵生产衣康酸。
3.6 其他微生物工程育种生产衣康酸
以葡萄糖为原料的土曲霉工业生产中，衣康酸 的生产水平局达146 g/L，但是，由于成本原因，衣康 酸的价格仍然过高，可以通过开发新菌株来实现价格的进一步降低。
蓝细菌在生物工业中显示出很高的潜力，利用 工程蓝细菌已经实现了从二氧化碳（c o2)生产出有 价值的产品，例如生物燃料和散装化学品。将
基因转人集胞藻PC C6803中，利用光合作用从二氧 化碳生产衣康酸，在5%COz持续鼓泡的条件下，产 生14. 5mg/L的衣康酸，生产速率为919 fig/L/d[34]。与非光合微生物相比，集胞藻可以通过连续的细胞生长来实现衣康酸的持续产生，在衣康酸生产中更 具优势和吸引力，但产量有待提高。
粗糖脉抱菌（Ne«rcw/>ora crawa)具有分泌纤维素酶的能力，利用粗糙脉孢菌生产衣康酸，通过将基因转人野生型粗糙脉孢菌FG SC 9720中使 纤维素直接转化为衣康酸，从而节省了原料和操作过程的成本，最终获得了 20mg/L的衣康酸产量[15]。
谷氨酸棒状杆菌对衣康酸具有高度的耐受性，并且不代谢衣康酸。在谷氨酸棒状杆菌
A T C C13032 中表达 C W，产生了 1.4 mmol/L衣康 酸；将C a d与大肠杆菌麦芽糖结合蛋白基因融合，衣康酸产量提高了两倍；通过将A T G起始密码子交换为G T G或T T G降低异柠檬酸脱氢酶活性，获得衣康酸最大产量为7.8 g/L，产率为2. 1 mmol/L/h3n!0
4结论
衣康酸作为一种可再生的有机酸，受到越来越 多的关注。土曲霉是衣康酸的主要生产者，但仍具有一
些缺点，筛选高产菌株，优化发酵条件一直是提 高衣康酸产量的重点。目前黑曲霉、耶氏解脂酵母、大肠杆菌、酵母菌和部分藻类已经作为具有衣
方舱康酸生产潜力的异源宿主被开发，改善关键酶的活 性，阻断竞争性副产物的合成途径以及增强代谢产
物运输的策略已用于改善衣康酸的生产，但是，异 源宿主的衣康酸产量仍然未达到土曲霉的生产
水平。
衣康酸产量的提高仍然存在问题，包括土曲霉 的生长抑制，衣康酸的低碳通量以及缺乏异源宿主
的代谢物转运蛋白。基因组，转录组，蛋白质组和代 谢组分析，以及合成生物学，可有助于了解衣康酸合 成的潜在机制，增加向衣康酸的碳通量，还可以用于 解决微生物的生长抑制问题。另外，目前发现的与 衣康酸代谢有关的转运蛋白可以解决底物的运输问题，从而提高其产量。腕表式激光仪
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