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2020年注定是不平静的一年，2019新型冠状病毒病（coronavirus disease 2019, COVID-19）的流行告诉世人，古老而又“流行”的传染病问题阴云不散，对人类健康造成极大的威胁。目前，新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）在全球范围内感染超过5 000万人，造成近130万人死亡。如果没有现代医学的检测和防治手段，这个数字可能会大大超出人们的想象。2020年诺贝尔生理学或医学奖授予哈维•阿尔特（Harvey J. Alter ）、迈克尔•霍顿（Michael Houghton ）和查尔斯•赖斯（Charles M. Rice ），以表彰他们“发现丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV ）”。HCV 研究在今年COVID-19大流行的背景下获奖，显得格外意义重大。 1 祸起隐微：病毒性肝炎传播中的小针头、大漏洞
20世纪伊始，现代医学快速发展，注射器、针剂的发明和使用，以及现代输血技术用于
外伤、外科手术失血过多的支持性或代偿性疗法，拯救了无数生命。然而，不论是全血，红细胞或血小板的成分输血，还是含有人血成分的疫苗、人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子Ⅷ等血液制品，在救死扶伤的同时，也给血液传播疾病敞开了大门。根据已知的研究，随血液传播的疾病超过60种。现
莱州地震在，只有经过病原体检测，才可以安全地进行输血，而肝功能和病毒性肝炎是献血检测中必须要进行的项目。
黄疸是肝炎导致肝功能障碍的标志之一。人体在发生胆红素代谢障碍时，血清内胆红素浓度升高，造成皮肤和眼睛巩膜变黄。早在约公元前400年希波克拉底就描述过“流行性黄疸”，我国约2 000年前先秦至汉的中医经典《黄帝内经》也对黄疸等肝炎症状进行了记录。19世纪末20世纪初，人们在防治天花、麻疹、梅毒或锥虫病的同时，由于自体疫苗等含有人类血清成分的疫苗使用，以及注射器的反复使用等不良医疗行为，造成了多次黄疸暴发。人们根据其血液传播途径的特征，将之命名为“血清肝炎”[1]。第二
† 通信作者，研究方向：分子病毒学及免疫学。E-mail:*************
doi:10.3969/j.issn.0253-9608.2020.06.003
分子生物学技术推进丙型肝炎病毒的发现和研究
李四光计划
——2020年诺贝尔生理学或医学奖解读
李庆超①，钟劲②†
①山东师范大学，济南 250000；②中国科学院上海巴斯德研究所，上海 200031
摘要 在全球范围内估计有7 100万丙型肝炎病毒感染者，其中相当多的患者会发展为肝硬化或肝癌，因此丙型肝炎病毒对人类健康造成重大威胁。2020年诺贝尔生理学或医学奖授予哈维•阿尔特、迈克尔•霍顿和查尔斯•赖斯，以表彰他们在“发现丙型肝炎病毒”工作中的卓越贡献。丙型肝炎病毒的研究历程无疑是人类与病毒斗争的胜利历史。从最初病毒的发现到抗病毒药物的成功研发，分子生物学技术的应用都发挥了关键的作用，为现代病毒学研究树立了典范。关键词 肝炎；丙型肝炎病毒；基因克隆；细胞培养模型
次世界大战期间，麻疹和黄热病疫苗的接种也导致一系列黄疸病暴发。例如，1942年，美军使用了含有人血清的黄热病疫苗后，造成约5万人黄疸发作[2]。研究人员推测是由于病毒性肝炎造成的急性肝损伤引起了黄疸，但是当时人们并不知道有哪几种肝炎病毒。
1947年，英国肝病专家麦克卡伦（F. O. MacCallum）根据流行病学研究数据，将病毒性肝炎分为口粪传播的甲型肝炎（hepatitis A）和血液传播的乙型肝炎（hepatitis B）两类。当时在美国输血引发肝炎的比例高达30%，因此鉴定肝炎病原体是进行血液安全性检测的必要前提。此后，生物医学领域的研究者经历了漫长的病毒性肝炎病毒寻之路，其中乙型肝炎病毒（HBV）直到1966年才被发现。当时巴鲁克•布伦博格（Baruch Blumberg）在澳大利亚原住民的血液中发现了“澳大利亚抗原”（后来研究证实为乙肝表面抗原HBsAg）[3]。布伦博格及其同事还在HBV检测、HBV致癌及HBV疫苗方面作出了卓越的贡献。1971年，美国食品和药物管理局（FDA）向血库发布有史以来的第一份血液供应检查
令，全美所有的血库都需对供血者实行强制性的乙肝表面抗原筛选，展开系统性清除输血造成的病毒性肝炎的工作。HBV 的发现工作使布伦博格获得1976年诺贝尔生理学或医学奖。
2 踪迹诡秘：神秘的非甲非乙型肝炎
哈维•阿尔特是布伦博格的同事，也参与了HBV的研究工作，1969年7月至今担任美国国立卫生研究院输血医学系的高级研究员。20世纪70年代中期，阿尔特及其研究小组注意到，在血库对HAV、HBV病毒进行严密检测的情况下，相当多病例输血后依然罹患肝炎，而且经检测发现，这些肝炎病例不是由于甲型肝炎或乙型肝炎病毒引起的。
科赫法则是19世纪末德国微生物学家科赫（Robert Hermann Koch）提出来的、用于建立微生物与疾病之间因果关系的四个标准，可以简单总结为：①病患中可以分离到这种微生物；②体外能够培养此种微生物；③体外培养此种微生物后，感染宿主可以导致相同疾病；④接种并患病的宿主中又可以再次分离到此种微生物。最初的科赫法则一方面受限于当时的微生物学发展水平，不能适用于难以培养的细菌和病毒；另一方面受限于伦理问题，仅能感染人的病原体也不能简单套用上述标准。科学家往往通过血清学的抗原抗体反应、电子显微镜形态观察以及动物实验等有限的手段对人类病原体进行研究。阿尔特与其合作者通过将甲肝及乙肝阴性的肝炎患者血清接种给黑猩猩，造成黑猩猩罹患肝炎，这个研究结果证明，确实还有一种新的病毒性肝炎病毒在人中流行。由于当时未鉴定到其病原体，
最初称之为“非甲非乙型肝炎”（non-A, non-B hepatitis, NANBH）[4]。不幸的是，按照以往的寻特异性抗体或直接观测病毒颗粒来研究NANBH病原体的传统方法，都屡试屡败。
3 原形毕露：丙型肝炎病毒的发现
要想检测某一病毒的存在，我们可以从三个方向来入手。①直接观察：直接观测病毒本体的存在。病毒的体积小，结构相对简单，需要通过电子显微镜对病毒进行观察。②病毒组分检测：如果不能直接观察到病毒的形态，可以通过检测病毒的某一组分的存在来证明病毒的存在。病毒一般由核酸和蛋白质衣壳组成，称为核衣壳，而包膜病毒除核衣壳结构外，还有脂质包膜及包膜蛋白。③病毒的影响：如果缺乏病毒或病毒组分的检测能力，可以通过检测病毒感染宿主造成的后果来间接检测病毒的存在，例如某些特征性的损伤或病理反应、免疫反应产生的特异性抗体引发的血清学现象等。第三个方向使用频率最高，但是为了证明一种全新病毒的存在，必须拿出第一和第二两种直接证据。
由于技术手段有限，病毒学长期依赖血清学手段进行研究。血清学作为一门科学始于1901年奥地利免疫学家卡尔•兰德斯坦纳（Karl Landsteiner, 1930年诺贝尔奖获得者）将红细胞分为A、B和O组。血清学是一种方便的诊断工
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具，因为免疫系统会在血液中为几乎每种异物或入侵微生物产生特定的分子标签——特异性抗体。不同的抗体专门结合特定的分子，例如病毒、寄生虫或细菌等病原微生物组分，以及毒药和药物等外来物质。血清学的应用为病原微生物学研究带来丰硕的成果，HBV 的发现就缘起一种HBV 特异性抗体的发现。直到今天，血清学方法依然是病原体检测或流行病学调查的重要手段。但是，血清学研究在NANBH 研究中失灵，加之直接观察病毒颗粒的尝试也失败，因此研究NANBH 病原体亟待采用新的方法。
南艺学分制病毒含有蛋白和核酸，能否通过检测核酸的方式来发现和检测病毒呢？事实上，不管是哪一种病毒，最重要的组分就是它的基因组。1952年T 2噬菌体实验（Alfred Hershey ，1969年诺贝尔奖）和1956年烟草花叶病毒重建实验分别证明，DNA 或RNA 是病毒的遗传物质。1953年DNA 双螺旋结构的发现被认为是现代分子生物学的标志性事件（James Watson 、Francis Crick ，1962年诺贝尔奖）。20世纪70年代，逆转录酶（Howard Temin 、David Baltimore ，1975年诺贝尔奖）、限制性内核酸内切酶（Werner Arber 、 Daniel Nathans 和Hamilton O. Smith ，1978年诺贝尔奖）、DNA 连接酶及DNA 重组技术（Paul Berg ，1980年诺贝尔奖）、DNA 测序技术（Frederick Sanger ，1980年诺贝尔奖，该技术包含了华裔科学家吴瑞发明的引物及应用）等一系列现代生物学成果纷纷涌现，使得直接研究生物体的基因组信息成为可能，从而彻底改变了生命科学发展的样貌。
1982年，病毒学家霍顿加入Chiron 公司，并主持非甲非乙型肝炎病原体的研究，与公司同事华裔博士郭劲宏（George Kuo ）和朱桂霖（Qui-Lim Choo ）及美国疾病控制与预防中心（CDC ）的布拉德利（Daniel W. Bradley ）合作，力图采用分子克隆的方法，直接寻病毒的遗传物质——核酸。他们将NANBH 病患样本中的RNA 抽提出来，反转录成为DNA ，然后经过限制性内切酶酶切后连接进入噬菌体载体中，形成一系列携带有重组DNA 片段的噬菌体。原则
上讲，这一携带有重组片段的噬菌体，像一个图书馆一样，含有几乎所有病患样品RNA 的序列信息，称之为基因文库。文库中不同噬菌体携带的序列包含病人本身所表达的RNA 序列，也有肝炎病毒自身的序列。文库噬菌体可以在细菌上进行生长和扩增，可以通过检测噬菌斑的DNA 序列来测定其所携带的外源DNA 。接下来的工作就是如何寻到病毒的序列了。在郭劲宏的建议下，霍顿决定采用针对NANBH 肝炎病毒蛋白质的特异性抗体来检测噬菌斑。因为含有NANBH 病毒序列的重组噬菌体可能会表达NANBH 特异性的蛋白，从而被抗体所检测到，也就是说，能够与特异性抗体反应的噬菌斑，大概率含有NANBH 病毒的基因。霍顿及其团队利用此策略，并对文库构建的起始血清及用于检测的特异性血清进行了优化。历经数年，筛选了数千万重组噬菌体，他们终于在1987年发现新病毒的一段序列，使用这段序列顺利地出几乎整个新病毒的基因组序列，并将新病毒命名为丙型肝炎病毒[5-6]。 自NANBH 概念的提出，到HCV 的发现，再到HCV 的检测方法的发明及输血全面筛查，由输血造成
的肝炎传播漏洞终于被补起来了。2000年，阿尔特和霍顿共同荣获拉斯克奖（不少科学家认为拉斯克奖及诺贝尔奖均遗憾地未授予布拉德利，布拉德利于1992年获得美国血库协会卡尔•兰德斯坦纳纪念奖，1993年获得罗伯特•科赫奖，2013年获得盖尔德纳基金会国际奖），奖励他们“发现丙型肝炎病毒的开拓性工作，以及开发出筛查方法，使美国输血相关的肝炎感染风险从1970年的30％降低到2000年的零感染”。
随着分子生物学及基因工程等发展，人类对微生物本质的认识越来越深刻，可用的技术手段也越来越丰富。以2003年SARS 为例，从该病的发现到病毒的分离仅用了5个月的时间，而从病毒分离到病毒基因组测序仅用了半个月的时间。随着第二代、第三代测序技术的发展，现在发现一种新的病原体只需要短短数天就可以完成。以COVID-19为例，从2019年底发现病例到食品安全质量检测学报
SARS-CoV-2测序完成仅用了1个月的时间，而送样到测序完成仅需要数天。
4 分毫析厘：感染性的全长HCV克隆的
构建
病毒是一类没有细胞结构的专性胞内寄生微生物。与其他生物相比，病毒在体外时更像一个生物大分子，但侵入宿主细胞后，借助宿主细胞的结构功能，在自己基因组的指导下完成复制过程，则表现出
生命的特性。我们人体免疫系统可以通过：①天然免疫，借助每一个细胞存在的天然免疫能力，识别和破坏病毒的成分或阻断其复制过程；②体液免疫，利用抗体在细胞外将病毒颗粒捕获并中和，破坏其侵染能力；③细胞免疫，杀灭已经被病毒感染的细胞，阻断和清除正在进行的感染过程，达到抗病毒的能力。一旦病毒具有逃逸宿主免疫系统的能力，病毒就有机会在人体中建立持续性感染，譬如HCV就有高达80%的概率引发慢性肝炎，进而导致肝硬化甚至肝癌。因此，特效药物及疫苗的研究都亟需展开，而HCV的研究模型便是人类战胜丙型肝炎所必须攻克的下一个堡垒。
病毒的专性胞内寄生特性导致科学家不得不借助于动物或细胞模型来帮助其在实验室内展开病毒学研究。当时唯一的实验模型是黑猩猩，黑猩猩是HCV的易感动物，但是使用黑猩猩做实验耗时长、费用昂贵。由于动物伦理的争议, 2013年美国国立卫生研究院宣布停止使用黑猩猩作为实验动物。单纯从病人体内获取病毒并感染黑猩猩并不能满足科学家对HCV开展研究的需求，科学家希望有一种可以进行遗传操作且在细胞或实验动物中能够复制的病毒研究模型——反向遗传操作系统。
早期遗传学研究的过程中，科学家是从表型出发来研究遗传学的相关问题的，需要通过自然突变或诱变的方式，筛选具有特殊表型的突变体，然后再定位决定这个表型的基因，并且研究基因的功能。从表型到基因型的研究思路就是正向遗传学。反向遗传学，顾名思义，是采用从基因型到表型的方式来探索基因的功能。在反向遗传学中，科学家拿到一个未知的基因，可以主动对这个基因进行突变或者改变它的表达量（过表达、低表达或敲除不表达），再去观察基因突变或基因表达量的变化引起什么
样的表型变化，并与野生型（没有经过人为改变的正常基因型）的表型进行比较，从而推测基因的功能。反向遗传学中，需要对特定的核酸序列进行改造，而这种改造的技术，实际上也是认识DNA这种遗传物质的结构和功能的过程，是在发展多种基因工程工具酶或者基因工程手段之后，才得以实现的。
我们进行遗传物质改造主要是在质粒上完成的，因为质粒是一种基因组外的、可以独立复制的游离DNA，其扩增比较方便，可以在细菌或酵母中进行。病毒的基因组通常比较小，因此我们可以把病毒基因组的双链接DNA副本组装在质粒中。把这些带有病毒序列的质粒DNA，或者由质粒指导转录产生的RNA送进细胞——这个过程叫做“转染”——可以指导细胞工厂产生病毒蛋白，复制新的病毒基因组，并组装释放，产生感染性病毒颗粒。
病毒的基因组可以是D N A，也可以是RNA。DNA病毒的基因组可以扩增、切割之后直接连入质粒；RNA病毒的基因组，则需要通过RNA指导合成DNA的逆转录过程，转化成DNA之后，再连入质粒。这些携带有病毒基因组序列、可以产生感染性病毒颗粒的质粒，就称作“感染性克隆”。将构建好的感染性克隆转染到细胞中，或转录成RNA之后转染细胞，就可以产生新的病毒。
阀体铸造感染性克隆构建好之后，病毒学家就可以很方便地在质粒上对病毒进行基因工程改造，将改造后的感染性克隆转入细胞中，就能产生带有突变的病毒，然后我们用这些新的病毒去感染细胞或宿主，观察
病毒的复制、宿主的症状等表型，就可以研究病毒相关基因的功能。这样一套系统，我们称之为病毒的“反向遗传操作系统”。
霍顿在尝试HCV感染性克隆的构建时，人工合成其所克隆获得的HCV基因组RNA，然后
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注射到黑猩猩肝脏中，但是并没有获得具有感染性的病毒颗粒。问题出在哪里呢？我们回过头来再检视一遍HCV 的基因组。HCV 基因组是一条单股正链RNA ，长约9.7 kb ，中间最大的是一个开放读码框，可以编码一个多聚蛋白，此蛋白可以加工成10个病毒蛋白。除了编码蛋白之外，HCV 基因组的两端非编码区和蛋白编码序列中间还存在RNA 单链内碱基配对折叠形成的RNA 二级结构，这些二级结构对HCV 的翻译和复制非常重要。难道霍顿所获取的HCV 基因组序列不完整？或者不正确？
查尔斯•赖斯早年在华盛顿大学医学院工作，2001年以来在洛克菲勒大学就职。1989年，赖斯在现已停刊的《新生物学家》（The New Biologist ）上发表了在实验室中生产感染性黄热病毒RNA 的方法。
该工作引起了同样研究丙型肝炎病毒的费斯通（Stephen Mark Feinstone ）的注意，在他的建议下，赖斯开始使用该技术研究丙型病毒。终于，赖斯在1997年成功获得第一个HCV 感染性克隆，将这个HCV 感染克隆的RNA 注射到黑猩猩肝脏后，黑猩猩表现出丙型肝炎的症状，且能够在其体内检测到感染性的HCV 病毒颗粒[7]。
与其他团队相比，赖斯之所以能够成功，是因为他在两个方面完善了HCV 基因组。第一，赖斯团队克隆得到HCV 的3′端最末端序列，获得真正完整的HCV 全长序列[8]。与其他正链RNA 病毒相似，HCV RNA 的非编码区（在此称为5′和3′非翻译区（5′UTR 和3′UTR ）包含重要的序列和结构元件，对HCV 翻译和RNA 复制至关重要。5′UTR 带有一个内部核糖体进入位点（IRES ），该位点通过帽独立的机制指导病毒蛋白翻译。作为RNA 合成的起始位点，5′UTR 和3′UTR 均包含对于病毒RNA 复制不可或缺的信号，只有完整的末端才能发挥正常的功能。第二，赖斯开创性地使用“共有序列”的策略取代直接从病人体内克隆获得的病毒序列，来制备感染性克隆序列。丙肝病毒基因组具有多变性，丙肝病毒存在7种不同的基因型和多达67种亚型，基因型之间的核苷酸差异度高达30%～
35%。相比之下，乙肝病毒不同基因型之间的差异仅有8%左右。这是由于丙肝病毒编码的RNA 聚合酶缺乏校正功能，错配率高。即便是在同一个病人体内存在的HCV 病毒颗粒，也可能包裹有存在序列差异的多种基因组，这种病人体内同一病毒的遗传异质性称为准种（quasispecies ）。也就是说，在同一病人体内获得的病毒序列不能简单地拼接在一起了事，因为这些克隆出来的序列与原始可复制的
病毒基因组相比，可能已经发生了突变而不能发挥作用。赖斯通过比较多条克隆序列，寻每一个位点上最常见的碱基序列，把它们合并成为一条“共有序列”。这个共有序列很有可能并不存在于病人体内，但是其每一个位点是大多数病毒基因组所携带的，大概率能够发挥正常功能，因此，基于共有序列制备的RNA 有更大概率具备复制能力。附庸
赖斯使HCV 感染性克隆可以感染黑猩猩，这是一项重大成就，为接下来的其他HCV 研究模型构建打下了基础，但是其仍然不能在实验室培养的细胞中复制，HCV 细胞研究模型工作远未结束。
5 工利其器：HCV细胞研究模型构建
为了战胜HCV ，研究HCV 的生物特性，开发HCV 方法和疫苗，一个简单易用且高效的HCV 细胞培养模型必不可少。借助感染性克隆，利用反向遗传操作技术，科学家可以改造并生成各种突变体病毒，通过观察表型变化进而研究病毒。病毒的细胞培养模型这一工具的使用，往往是在攻克病毒病历程中发力最大的“刺客尖兵”，能够带来一系列的科研成果。
德国科学家拉尔夫•巴尔滕施拉格（Ralf Bartenschlager ）在霍顿发布HCV 基因组后也在尝试构建HCV 的感染性克隆，同样经历了种种失败。既然完整的感染过程不能在细胞培养上实现，能否先实现部分HCV 复制过程呢？拉尔夫和V olker Lohmann 提出了一个有趣的计划：他们把HCV 病毒基因组中与RNA 复制无关的部分去除，成功使用不完整的缺陷型基因组来构建HCV
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