研究蛋白互作的方法蛋白互作的研究一直以来都受到重视，是研究细胞信号传导等非常重要的方面。我就我现在做过的方法给大家介绍一下，抛砖引玉了，大家多补充纠正一下吧常用的体外互作研究方法：1、酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2h)酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今，并且仍然保持着自己的优势。酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用， 具有高度敏感性。酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。优点在于:优点: ⑴ 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵ 检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。实验语音学⑷ 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库， 能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能 的蛋白。
但是酵母双杂交有自己的缺点：Snaglt⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。 另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。
官僚制“假阳性”对策：即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析： (1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。 （2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。 （3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。所以对于做出来有互作的结果还应该继续通过别的方法来验证。
“假阴性”的产生：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。东方管理
2、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）
用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
优点在于：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响； （3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
护理学杂志缺点在于：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用； （2）两
种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。所以可以作为酵母双杂交的进一步的验证，达到互补的效果。
体内互作的研究
1、荧光共振能量转移（FRET）
荧光共振能量转移(FRET)：当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子) 的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET 程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10 nm 时即可发生FRET; 随着距离延长，FRET呈显著减弱。
由于只有在蛋白之间的距离达到10nm一下才会发生FRET，而10nm要小于蛋白互作要求的距离，所以FRET是衡量体内互作的强有力的证据。
2、双分子荧光互补(BiFC)
是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作
用的新技术。该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用.其后发展出的多荧光互补技术(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.目前，该技术已用于转录因子，G蛋白βγ亚基的二聚体形式，不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上。
由于BiFC的直观，而且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义。所以，BiFC越来越受到研究人员的青睐。
川草乌酵母双杂交的相关知识
时间：2009-12-29 16:45:17 来源： 作者： 点击： 153次
结构组成：
酵母双杂交系统可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。利用此系统已分析和测定了多种重要结构域， 如p85三磷酸肌醇激酶和p110亚单位作用的结构域v，
p21cip1蛋白与增殖细胞膜抗原(proliferating-cell nuclear antigen， PCNA) 的结合序列vi等。
此外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域，绘制蛋白质联系图谱，在药物设计等许多方面。
特点与优点：
酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点: ⑴ 作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵ 检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷ 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。例如已报道成功分析了RAP1与RIF1ii、P21cip1与CDK2iii、 p16与CDK4iv等之间的相互作用。
局限性和存在的问题
酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。
许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展。例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少"假 阳性"的发生；发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白将的相互作用。其中双筛选系统用二种不同的报告基因(常用lacZ和HIS3)有以下优势vii:⑴ 用不同的启动子表达位于酵母二个染体上的报告基因，可明显减少假阳性。⑵ 通过营养型筛选增强了筛选能力，尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。
哺乳动物双杂交系统Ⅷ也是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础的体内分析方法。在此系统中，一种感兴趣的蛋白与Gal4--DNA结合结构域构成融合蛋白，另一种蛋白与单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域以融合蛋白表达。表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体（CAT）共同转染哺乳动物细胞系。报道质粒含一个Gal4结合位点下游的cat基因。假如两个融合蛋白相互作用则cat报道基 因表达水平明显增高。用此系统证实了P53蛋白与大T抗原的相互作用， 得到了酵母双杂交系统相同的结果。且较酵母双杂交系统更为快速，在转染48h内得到结果。并且在哺乳动物细胞能更好模仿体内的蛋白-蛋白相互作用。因而，哺乳动物双杂交系统可作为酵母双杂交系统的辅助手段。
酵母双杂交基本原理
时间：2009-12-29 16:32:07 来源： 作者： 点击： 170次
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的
其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一
般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。 同时， 酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
研究蛋白质相互作用的技术平台―酵母双杂交系统的发展和应用
时间：2010-03-08 15:40:01 来源： 作者： 点击： 339次
随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时
代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互作密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。
酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。
酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组
件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议