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本技术介绍了一种产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用。所述疫苗包蛋白组合物以及医药学上可接受的载剂，所述蛋白组合物包含分别具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10所示序列的三种融合蛋白。本技术提供的所述疫苗无任何毒性，安全性高，免疫原性好，能够在动物体内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，并且还可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，具有质控容易、批次间稳定、生产成本低等优点。 技术要求
1.蛋白组合物，包含：序列如SEQ ID NO:2所示的第一融合蛋白，序列如SEQ ID NO:6所
示的第二融合蛋白和序列如SEQ ID NO:10所示的第三融合蛋白。
2.基因组合物，包含分别用于编码权利要求1所述蛋白组合物中第一融合蛋白、第二融合蛋白、第三融合蛋白的编码基因。
3.如权利要求2所述的基因组合物，其特征在于包含：序列如SEQ ID NO:1所示的第一核酸分子，序列如SEQ ID NO:5所示的第二核酸分子和序列如SEQ ID NO:9所示的第三核酸分子。
4.重组载体组合物，包括：
包含权利要求1所述蛋白组合物中第一融合蛋白的编码基因的第一重组载体；
包含所述蛋白组合物中第二融合蛋白的编码基因的第二重组载体；以及
三诺h222包含所述蛋白组合物中第三融合蛋白的编码基因的第三重组载体。
5.如权利要求4所述的重组载体组合物，其特征在于：所述第一重组载体、第二重组载体、第三重组载体包括pFastBac1或pVL1393。中南集团企业管理信息系统
6.宿主细胞组合物，包括：
包含权利要求1所述蛋白组合物中第一融合蛋白的编码基因的第一宿主细胞；
包含所述蛋白组合物中第二融合蛋白的编码基因的第二宿主细胞；以及
包含所述蛋白组合物中第三融合蛋白的编码基因的第三宿主细胞。
7.如权利要求6所述的宿主细胞组合物，其特征在于：所述第一宿主细胞、第二宿主细胞、第三宿主细胞选自Sf9细胞系，所述Sf9细胞系包括Sf9、High Five或 Sf21细胞。
8.一种免疫组合物，其特征在于包括：权利要求1所述的蛋白组合物；以及，医药学上可接受的载剂。中国包装总公司
9.如权利要求8所述的免疫组合物，其特征在于：所述医药学上可接受的载剂包括MONTANIDE ISA 20
6 VG、MONTANIDE ISA 201 VG、MONTANIDE ISA 15 VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素之中的任意一种或者两种以上的组合。
10.一种蛋白组合物的制备方法，其特征在于包括：
提供权利要求1所述蛋白组合物中第一融合蛋白、第二融合蛋白、第三融合蛋白的编码基因；
分别将所述第一融合蛋白的编码基因、第二融合蛋白的编码基因、第三融合蛋白的编码基因克隆到穿梭载体中，分别获得含有相应目的基因的第一重组穿梭载体、第二重组穿梭载体、第三重组穿梭载体；
分别将所述第一重组穿梭载体、第二重组穿梭载体、第三重组穿梭载体转化感受态细胞，并分离获得分别含有相应目的基因表达框的第一重组杆状病毒基因组质粒、第二重组杆状病毒基因组质粒、第三重组杆状病毒基因组质粒；
分别以所述第一重组杆状病毒基因组质粒、第二重组杆状病毒基因组质粒、第三重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞，并分别获得相应的第一重组杆状病毒、第二重组杆状病毒、第三重组杆状病毒；
分别将所述第一重组杆状病毒、第二重组杆状病毒、第三重组杆状病毒接种昆虫细胞并进行培养，之后分离获得所述第一融合蛋白、第二融合蛋白、第三融合蛋白。英汉对比
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述穿梭载体包括pFastBac1或
pVL1393；和/或，所述昆虫细胞选自Sf9细胞系，所述Sf9细胞系包括Sf9、High Five或
Sf21细胞。
12.一种产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包括：采用权利要求10-11中任一项所述的方法制备第一融合蛋白、第二融合蛋白、第三融合蛋白，并将所述第一融合蛋白、第二融合蛋白、第三融合蛋白与医药学上可接受的载剂混合。
13.如权利要求1所述蛋白组合物或权利要求8或9所述免疫组合物在制备产气荚膜梭菌检测试剂，在生产用于在受试动物中诱导针对产气荚膜梭菌抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受产气荚膜梭菌感染的药剂中的用途。
14.如权利要求1所述蛋白组合物或权利要求8或9所述免疫组合物在制备产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗中的用途。
技术说明书
产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用
技术领域
本技术涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用，属于动物免疫药物技术领域。
背景技术
产气荚膜梭菌（Clostridium Perfringens，CP）是一种重要的人畜共患病的病原，可以引起人和家畜的多种疾病，如牛羊猝狙、羔羊痢疾和羊肠毒血症；猪胀气及猝死、仔猪坏死性肠炎；马、鹿、兔的梭菌性肠炎等。不仅威胁着人类的健康，而且对畜牧业造成了巨大的经济损失。由于产气荚膜梭菌病具有发病急、病程短且死亡率极高的特点，因此免疫接种是防控该病的有效方法。目前已证实产气荚膜梭菌至少存在15种以上外毒素，其中α、β、ε、ι毒素是四种主要致病性毒素，根据分泌毒素的类型可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D和E五个型。很多菌株还产生肠毒素（Clostridium Perfringens，CPE）、β2毒素以及坏死性肠炎B样毒素（Necrotic nteritis B-like toxin，NetB）等。产气荚膜梭菌α毒素（clostridiumperfringens α toxin）是产气荚膜梭菌最重要的毒素之一，它具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板凝集和增加血管渗透性等特性。α毒素对A型产气荚膜梭菌感染的免疫预防有着极为重要的意义。产气荚膜梭菌β1毒素（clostridium perfringens β1toxin）只能从B型和C型产气荚膜梭菌中分离得到，具有致死性，形成组织坏死并且对胰蛋白酶稳定，是一种神经毒素。产 气荚膜梭菌β2毒素（clostridium perfringens β2 toxin）存在于C型产气荚膜梭菌培养物中，与β1毒素具有相似的生物学活性，抗β2毒素的抗体能识别纯化的β2毒素，并能与β1毒素发生弱反应，然而，抗β1毒素的抗体只能与β1毒素反应，却不能与β2毒素发生反应。β1毒素和β2毒素均具有细胞毒性，能够引发肠粘膜的出血性坏死。产气荚膜梭菌ε毒素（clostridium perfringens epsilon toxin）是由B型和D型气荚膜梭菌产生的一种坏死性和致死性毒素，它可促使动物的主动脉和其它动脉收缩而导致血压升高，还具有与血管上皮受体结合的能力，使血管通透性增高，最终引起致死性水肿。ι毒素（iota-toxin）仅由E型气荚膜梭菌分泌，由Ia和Ib两个部分构成。Ia和Ib单独存在时均无毒性，同时存在时具有细胞毒性、致死性。NetB毒素可以从A型和C型气荚膜梭菌中分离出来，NetB毒素作为一种分泌毒素极易作用于宿主免疫系统。
当前产气荚膜梭菌病免疫所用疫苗主要是类毒素灭活疫苗，此种类毒素疫苗的生产由于需要产气荚膜梭菌的培养、毒素的灭活及浓缩，因而存在成本高、耗时长、病原菌扩散等缺点。而如CN110051834A、CN107308445A等提供的基因工程疫苗都只能保护某一个或者某几个梭菌引起的感染，不能提供全面的保护，且重组蛋白是在包涵体中获得表达，免疫原性较差。此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，容易产生不良反应甚至导致免疫失效。
有鉴于此，业界亟待发展出一种能够同时表达多种毒素蛋白的、安全性高、免疫原性强的基因工程亚
单位疫苗。
技术内容
本技术的主要目的在于提供一种产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述技术目的，本技术采用的技术方案包括：
本技术实施例提供了一种蛋白组合物，包含：具有SEQ ID NO:2所示序列或者与SEQ IDNO:2的全长序列95％以上相同的序列的第一融合蛋白，具有SEQ ID NO:6所示序列或者与SEQ ID NO:6的全长序列95％以上相同的序列的第二融合蛋白，具有SEQ ID NO:10所示序列或者与SEQ ID NO:10的全长序列95％以上相同的序列的第三融合蛋白。
即，本技术实施例提供的各融合蛋白的氨基酸序列可以是原始序列，增加或截短的序列。
本技术实施例还提供了一种基因组合物，包含分别用于编码所述蛋白组合物中第一融合蛋白、第二融合蛋白、第三融合蛋白的编码基因。
薛万东在一些实施方式中，所述的基因组合物包含：具有SEQ ID NO:1所示序列或者与SEQ ID NO:1的全长
银监会序列95％以上相同的序列的第一核酸分子，具有SEQ ID NO:5所示序列或者与SEQ ID NO:5的全长序列95％以上相同的序列的第二核酸分子，具有SEQ ID NO:9所示序列或者与SEQ ID NO:9的全长序列95％以上相同的序列的第三核酸分子。
本技术实施例还提供了一种重组载体组合物，包括：
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