(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810117693.0
(22)申请日 2018.02.06
(71)申请人 中国科学院生物物理研究所
地址 100101 北京市朝阳区大屯路15号
(72)发明人 朱明昭 王文君
(74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任
公司 11021
代理人 单骁越
(51)Int.Cl.
A61K 39/385(2006.01)
A61K 39/29(2006.01)
A61K 39/12(2006.01)
A61K 39/145(2006.01)
A61K 47/65(2017.01)
A61K 47/69(2017.01)
A61P 31/20(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明提供用于制备疫苗的铁蛋白纳米颗
校正系数
粒载体，并且还提供基于所述铁蛋白纳米颗粒载双重危机
体的疫苗，及其制备方法。所述铁蛋白纳米颗粒
载体由与SpyCatcher融合表达的铁蛋白自组装
而成，或由与SpyTag融合表达的铁蛋白自组装而嘧霉胺
服务质量分析成，当所述纳米颗粒载体由与SpyCatcher融合表
达的铁蛋白自组装而成时，所述疫苗还包含与
SpyTag融合表达的抗原，当所述纳米颗粒载体由
与SpyTag融合表达的铁蛋白自组装而成时，所述
疫苗还包含与SpyCatcher融合表达的抗原，其中
铁蛋白与所述抗原之间通过SpyCatcher-SpyTag
相互作用共价连接。
权利要求书1页 说明书15页序列表18页 附图24页CN 108434450 A 2018.08.24
C N 108434450
A
1.铁蛋白纳米颗粒载体，所述纳米颗粒载体由与SpyCatcher融合表达的铁蛋白自组装而成，或由与SpyTag融合表达的铁蛋白自组装而成。
2.根据权利要求1所述的铁蛋白纳米颗粒载体，其中所述SpyCatcher或SpyTag融合表达在铁蛋白的N端。
3.根据权利要求1所述的铁蛋白纳米颗粒载体，其中所述铁蛋白来源于强烈炽热球菌。
4.根据权利要求1所述的铁蛋白纳米颗粒载体，其中SpyCatcher与铁蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，SpyTag与铁蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的铁蛋白纳米颗粒载体在制备疫苗中的用途。
6.基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗，所述疫苗包含权利要求1-4中任一项所述的铁蛋白纳米颗粒载体，当所述纳米颗粒载体由与SpyCatcher融合表达的铁蛋白自组装而成时，所述疫苗还包含与SpyTag融合表达的抗原，当所述纳米颗粒载体由与SpyTag融合表达的铁蛋白自组装而成时，所述疫苗还包含与SpyCatcher融合表达的抗原，其中铁蛋白与所述抗原之间通过SpyCatcher -SpyTag相互作用共价连接。
7.根据权利要求6所述的基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗，其中所述抗原选自乙肝病毒preS1蛋白、流感病毒M2e蛋白、丙肝病毒E2蛋白、人乳头瘤病毒E7蛋白。
8.根据权利要求6所述的基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗，其中所述抗原是乙肝病毒preS1蛋白，优选地，所述疫苗包含由与SpyTag融合表达的铁蛋白自组装而成的纳米颗粒载体和与SpyCatcher融合表达的乙肝病毒preS1蛋白，优选地，SpyTag与铁蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，并且SpyCatcher与乙肝病毒preS1蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
9.根据权利要求8所述的基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗用于制备乙型肝炎病毒预防性或性疫苗的用途。
10.根据权利要求6所述的基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗，其中所述抗原是人乳头瘤病毒E7蛋白，优选地，所述疫苗包含由与SpyCatcher融合表达的铁蛋白自组装而成的纳米颗粒载体和与SpyTag融合表达的人乳头瘤病毒E7蛋白，优选地，SpyCatcher与铁蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且SpyTag与人乳头瘤病毒E7蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
11.根据权利要求10所述的基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗用于制备用于宫颈癌的药物的用途。
12.根据权利要求6所述的基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗，其还包含佐剂，优选地，所述佐剂选自Toll样受体9的配体CpG -ODN、Toll样受体4的配体MPLA、铝佐剂。
权 利 要 求 书1/1页CN 108434450 A
基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于纳米颗粒载体技术领域，具体而言是以铁蛋白纳米颗粒为基础，利用SpyCatcher-S
pyTag蛋白连接技术，建立一种能够快速连接蛋白质分子的纳米颗粒载体系统。利用该系统可以简单方便有效地将病毒抗原和肿瘤抗原等多种蛋白抗原以共价键的形式连接到铁蛋白纳米疫苗载体上，形成相应的铁蛋白纳米疫苗。
背景技术
[0002]纳米颗粒材料的理化特征赋予其许多独特的生物学性状，广泛用于疫苗、药物等的研发中。铁蛋白是广泛存在于生物体的铁贮藏蛋白，可自组装形成纳米颗粒，是生物纳米材料研究领域的热点。在疫苗研发中，铁蛋白是理想的抗原载体。Masaru Kanekiyo等将流感病毒H1N1的HA蛋白融合表达在幽门螺旋杆菌铁蛋白的N端，形成表面带有8个HA三聚体的纳米疫苗，与灭活三价流感病毒疫苗相比，能引起10倍以上的抗体应答的增强，同时还能产生广谱性的保护作用(Kanekiyo,Wei et al.2013)。Sebyung Kang实验室对强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)铁蛋白进行了改造，将OTI、OTII肽段融合表达在铁蛋白的表面(第142位氨基酸处)或C 端形成纳米疫苗，能够引起较强的CD4、CD8T细胞应答(Han,Kang et al. 2014)。此外，将HIV的外壳蛋白融合表达在铁蛋白纳米颗粒的表面也能在小鼠中引起8倍左右抗体应答的增强(Sliepen,Ozorowski et al.2015)。可见，用铁蛋白纳米颗粒展示抗原，能够显著地增强抗原的免疫原性，引起更强的体液、细胞免疫反应，因此铁蛋白是理想的纳米疫苗平台。在药物研发中，铁蛋白还被用于化疗药物或探针的载体，用于肿瘤的诊断和。
[0003]HBV(hepatitis B virus，HBV)病毒是噬肝DNA病毒属的双链DNA 病毒，能够通过血液或体液传播。HBV感染会引起不同程度的肝脏损伤，包括急性、慢性肝炎，肝纤维化，肝硬化和肝癌。全球范围内大约有2.57 亿的慢性乙型肝炎患者，每年约有100万患者死于HBV 感染所引起的晚期并发症。在我国慢性乙型肝炎是严重危害人民健康的重大传染病。目前临床上的乙肝疫苗均为预防HBV感染的预防性疫苗，慢性乙型肝炎的方式则主要是抗病毒药物(核苷(酸)类似物、病毒唑)和干扰素等，它们通过抑制病毒的复制来发挥作用但不能彻底地清除病毒，大多数患者需要长期而且易产生耐药性等副作用。因此，免疫将成为乙型肝炎的重要手段，性疫苗的研制具有十分重要的意义。
[0004]preS1是large HBsAg N端的一段氨基酸序列(ay型为108个氨基酸， ad型为119个氨基酸)，preS1能够与肝脏细胞表面的NTCP结合从而介导 HBV的感染。一段与preS1第2-48位氨基酸序列相同的N端十八烷基化修饰的多肽可以在体外阻止HBV感染肝脏细胞，也可在小鼠模型中预防 HBV的感染。因此产生针对preS1的特异性抗体能够中和HBV病毒并且保护宿主免受感染。由于preS1蛋白本身的免疫原性较弱，只有联合了较强佐剂情况下才能诱导免疫反应，所以一种可以有效引起preS1特异性抗体应答的疫苗形式有待出现。
[0005]SpyCatcher-SpyTag蛋白连接系统是由英国科学家Mark Howarth在 2012年建立的，它来源于酿脓链球菌纤连蛋白结合蛋白FbaB的CnaB2结构域(Zakeri,Fierer et
词牌名 春>化学镀镍磷
al.2012)。CnaB2为一个分割蛋白，通过结构生物学和工程学的方法可以将CnaB2分割成一个含有138氨基酸的蛋白 SpyCatcher和一个含有13个氨基酸的多肽SpyTag。当它们相遇的时候，几分钟内就可以通过SpyTag的天冬氨酸和SpyCatcher的赖氨酸之间形成酰胺键共价结合形成一个完整的蛋白。SpyCatcher-SpyTag蛋白连接系统与化学偶联、酶联等传统方法相比具有反应条件简便、特异性高、效率高、产量大、反应产物稳定等优点。为了进一步优化SpyCa tche r-Spy Tag这个系统以使其更适用于疫苗的构建，我们曾尝试在不影响SpyCatcher与 SpyTag结合能力的情况下将SpyCatcher进行截短，形成的ΔN SpyCatcher (N端氨基酸24-47截短，简称SC)免疫原性降低，更适合应用于疫苗的生产。
发明内容
[0006]本发明利用SpyCatcher-SpyTag蛋白连接系统生产了一种能快速连接抗原的铁蛋白纳米疫苗系统，将乙肝病毒表面抗原preS1连接到铁蛋白表面制成的纳米疫苗可以显著地增强preS1特异性的抗体水平，能够有效地预防HBV的感染，同时具有性效果。将人乳头瘤状病毒E7抗原连接到铁蛋白表面制成的纳米疫苗可有效地控制小鼠宫颈癌的生长，是一种有效的肿瘤性疫苗。此外，其他病毒、肿瘤相关抗原也可利用 SpyCatcher-SpyTag 蛋白连接系统快速连接到铁蛋白纳米疫苗载体上，实现了纳米疫苗的快捷、高效地生产。可用于本发明的SpyCatcher-SpyTag蛋白连接可以是原型SpyCatcher或其衍生物与原型SpyTag或其衍生物介导的蛋白质连接，特别地，本发明中使用的SpyC
atcher可以是N端截短的 SpyCatcher(ΔN SpyCatcher)。
[0007]本发明的目的是提供有效的预防性和性疫苗，所述疫苗是一种以铁蛋白为载体的纳米疫苗，其具有制备迅速、效果显著的特点，解决了疫苗制备周期长、弱免疫原应答低等问题。
[0008]在本发明的一些方面中，测试了乙肝病毒preS1蛋白、流感病毒M2e 蛋白、丙肝病毒E2蛋白以及人乳头瘤病毒E7蛋白等多种抗原，与未连接形式的相应抗原疫苗相比，铁蛋白纳米疫苗诱导产生了几倍-几十倍的抗体应答或T细胞应答。例如，在小鼠乙肝感染模型中，该疫苗显示了出的预防和作用。在小鼠宫颈癌模型中，该疫苗具有显著的效果。
[0009]更具体地，本发明提供以下各项：
[0010] 1.铁蛋白纳米颗粒载体，所述纳米颗粒载体由与SpyCatcher融合表达的铁蛋白自组装而成，或由与SpyTag融合表达的铁蛋白自组装而成。
[0011] 2.根据1所述的铁蛋白纳米颗粒载体，其中所述SpyCatcher或SpyTag 融合表达在铁蛋白的N端。
[0012] 3.根据1所述的铁蛋白纳米颗粒载体，其中所述铁蛋白来源于强烈炽热球菌。[0013] 4.根据1所述的铁蛋白纳米颗粒载体，其中SpyCatcher与铁蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，
SpyTag与铁蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0014] 5.根据1-4中任一项所述的铁蛋白纳米颗粒载体在制备疫苗中的用途。[0015] 6.基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗，所述疫苗包含1-4中任一项所述的铁蛋白纳米颗粒载体，当所述纳米颗粒载体由与SpyCatcher融合表达的铁蛋白自组装而成时，所述疫苗
还包含与SpyTag融合表达的抗原，当所述纳米颗粒载体由与SpyTag融合表达的铁蛋白自组装而成时，所述疫苗还包含与SpyCatcher融合表达的抗原，其中铁蛋白与所述抗原之间通过 SpyCatcher-SpyTag相互作用共价连接。
[0016]7.根据6所述的基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗，其中所述抗原选自乙肝病毒preS1蛋白、流感病毒M2e蛋白、丙肝病毒E2蛋白、人乳头瘤病毒 E7蛋白。
[0017]8.根据6所述的基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗，其中所述抗原是乙肝病毒preS1蛋白，优选地，所述疫苗包含由与SpyTag融合表达的铁蛋白自组装而成的纳米颗粒载体和与SpyCatcher融合表达的乙肝病毒preS1蛋白，优选地，SpyTag与铁蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7 所示，并且SpyCatcher与乙肝病毒preS1蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:11所示。
[0018]9.根据8所述的基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗用于制备乙型肝炎病毒预防性或性疫苗的用途。
[0019]10.根据6所述的基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗，其中所述抗原是人乳头瘤病毒E7蛋白，优选地，所述疫苗包含由与SpyCatcher融合表达的铁蛋白自组装而成的纳米颗粒载体和与SpyTag融合表达的人乳头瘤病毒E7 蛋白，优选地，SpyCatcher与铁蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示，并且SpyTag与人乳头瘤病毒E7蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:13所示。
[0020]11.根据10所述的基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗用于制备用于宫颈癌的药物的用途。
[0021]12.根据6所述的基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗，其还包含佐剂，优选地，所述佐剂选自Toll样受体9的配体CpG-ODN、Toll样受体4的配体MPLA、铝佐剂。
附图说明
[0022]图1.铁蛋白纳米疫苗平台结构示意图。A.ΔN SpyCatcher(SC)融合表达在铁蛋白亚基N端第五个氨基酸处，24个SC-铁蛋白亚基自组装形成表面呈递SC的纳米颗粒结构；
B.SC-铁蛋白纳米疫苗平台可与带有SpyTag 的抗原结合形成单价或多价纳米疫苗；
C.SpyTag融合表达在铁蛋白亚基N 端第五个氨基酸处，24个SpyTag-铁蛋白亚基自组装形成表面呈递SpyTag 纳米颗粒结构；
D.SpyTag-铁蛋白纳米疫苗平台可与带有SC的抗原结合形成单价或多价纳米疫苗。
[0023]图2.铁蛋白纳米疫苗平台的纯化和生化特征。A.SC-铁蛋白经预装柱 Superose 6层析的纯化图谱。蓝线为280nm吸收峰，红线为260nm吸收峰，SC-铁蛋白的洗脱峰在13.5ml左右；B.纯化后的SC-铁蛋白还原性 SDS-PAGE电泳结果图，SC-铁蛋白一个亚基的分子量约34.1kDa；C. SpyCatcher-铁蛋白纳米疫苗平台在透射电子显微镜下拍摄结果图；D. SpyTag-铁蛋白经预装柱Superose 6层析的纯化图谱。蓝线为280nm吸收峰，红线为260nm吸收峰，SpyTag-铁蛋白的洗脱峰在15ml左右；E. 纯化后的SpyTag-铁蛋白还原性SDS-PAGE电泳结果图，SpyTag-铁蛋白一个亚基的分子量约22.4kDa；F.SpyTag-铁蛋白纳米疫苗平台在透射电子显微镜下拍摄结果图。
[0024]图3.铁蛋白-preS1、铁蛋白-E7纳米疫苗的纯化和生化特征。A. SpyTag-铁蛋白和SC-preS1按不同的摩尔比例混合，4℃过夜后还原性 SDS-PAGE电泳结果图，摩尔比分别为
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