实验三 血清总蛋白的测定
【目的要求】
1.双缩脲法测定蛋白质含量的实验原理、关键技术和特点意义。 2.熟悉双缩脲法测定蛋白质的剂量反应曲线的制作方法与原则*
3.熟悉721分光光度计的使用和常规维护
【实验原理】
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应 [A]，生成紫红络合物。
蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应[B]，生成的紫红络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10~120g/L范围内有良好的线性关系。
据此，对已知系列浓度的蛋白标准液（S1~S5）做双缩脲反应，用其浓度作横坐标，吸光度为纵坐标，即可绘出一条过原点的蛋白质双缩脲反应剂量曲线。通过此曲线，便可查出测定管的蛋白质浓度，进而求算出标本的总蛋白浓度。亦可通过测定管吸光度、任一标准管的吸光度和该标准管的蛋白质浓度，算出标本中的总蛋白浓度。
【实验准备】
一、器材
1.试管及试管架
2.0.2ml微量吸管或200μl微量加液器
3.1ml、2ml、5ml刻度吸管
4.721型分光光度计
5.坐标纸及绘图工具
二、试剂
1.0.9% NaCl溶液 用医用生理盐水代替或按文献自配。
2.6mol/L NaOH溶液 称取AR级NaOH 240.0g，溶于约800ml新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，冷却后稀释至1OOO.0ml，贮存于有盖塑料瓶中。若用非新开瓶的NaOH，须先配成饱和溶液，静置2周左右，使碳酸盐沉淀，其上清饱和NaOH溶液经滴定后，算出准确的浓度再使用。
3.双缩脲试剂 称取AR级的结晶硫酸铜（CuSO4·5H2O ）3.0g，溶于新鲜制备的蒸馏水（或刚煮沸冷却的去离子水）500ml中，加入AR级酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）9.0g，用以结合Cu2+，防止CuO在碱性条件下沉淀，再加入KI 5.0g，防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu2O的离析。待所加试药完全溶解后，在搅拌下加入6mol/L NaOH溶液100ml，再加蒸馏水稀释至1,000ml，混匀，置塑料瓶中盖紧保存，常温下可达半年。若贮存瓶中发现有黑沉淀，则需要重新配置。
4.1%蛋白标准液（1ml=10mg） ⑴可用当地质控中心提供的标准血清配制，如取定值为75g/L之标准血清1.0ml，用生理盐水准确稀释至7.5ml即成；⑵也可用市售冻干牛血清白蛋白或酪蛋白配制。如精确称取电泳单点纯的商品牛血清白蛋白500.0mg，置50CC小烧杯中，加约25ml生理盐水溶解、转入标准的50CC容量瓶中，用生理盐水准确稀释至刻度即成。整个配制过程中勿使产生泡沫。最后置4℃冰箱保存备用。
5.血清标本（1∶10） 准确吸取0.2ml正常血清，用0.9% NaCl溶液稀释至2.0ml备用。
【实验操作】
1.加液 取10CC干净试管若干支，按下表所示，标明管号，进行双管/三管平行操作。
蛋白质双缩脲反应剂量曲线的制作与血清蛋白质测定实验操作表
管号 加入物(ml) | B (B1环球新闻眼, 1’) | S1 (S1,1’, 1’’) | S2 (S2,2’,2’’) | S3 (S3,3’,3’’) | S4 (S4,4’,4’’) | S5 (S5,5’,5’’) | U1 (U1, 1’) | U2 (王新军U2, 2’) |
⑴血清标本（1∶10） | — | — | — | — | — | — | 0.5 | 0.5 |
⑵1%蛋白质溶液 | — | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | — | — |
⑶0.9% NaCl溶液 | 0.5 | mm理论 0.4 | 0.3 | O.2 | 0.1 | — | — | —精神医学 |
⑷双缩脲试剂 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
| | | | | | | | |
2.比 混匀上表各管，置37°C水浴20 min，之后用721分光光度计比，波长540nm，光径1cm，以空白调零，记录各平行管的吸光度，算出各总管的平均吸光度一并填入下列比记录表中（见本实验报告）
3.作图 以蛋白质浓度为横坐标，平均吸光度为纵坐标，选择适当的纵横坐标分度值，在座标纸上便可绘出一条过原点而成45°的蛋白质双缩脲剂量反应曲线。
4.求算标本血清中的蛋白质浓度
⑴查图：利用测定管的平均吸光度 AU1、AU2，在所绘的剂量反应曲线上查出总蛋白浓度X1和X2，最后算出标本的平均总蛋白浓度（X）。
⑵计算：按下列公式计算
将AU1、AU2，分别代入AU，将任一标准管，如S3的吸光度代入AS，再乘S3的蛋白质浓度,即可算出样品平行测定管的蛋白质浓度（X1、X2）和平均总蛋白浓度（X）。
【临床意义】
1.血清总蛋白参考值：60~80g/L
2.血清总蛋白浓度异常
⑴降低多见，主要见于蛋白质合成障碍，蛋白质丢失增加，营养不良或消耗增加，血浆稀释。
⑵增高相对少见，临床常见于急性脱水等引起的血浆浓缩，也见于因多发性骨髓瘤患者异常球蛋白合成增加而致血清总蛋白浓度增高
【注意事项】
1.剂量反应曲线的制作与使用 剂量反应曲线是待测物质与试剂作用的表观实验指标（如吸光度）与该物质量浓度（已知浓度系列）间的关系曲线，常用于评价测试方法的线性关系和线性范围。也用于待测物质浓度测定中。为提高评价线性关系、线性范围和定量测定的准确性，剂量反应曲线的制作与使用应该：⑴在最佳常规实验条件下进行剂量反应曲线的制作，⑵标准溶液和样品溶液的蛋白质浓度均不宜超过每ml 10mg，⑶使标准管系列成为精确的浓度等差系列，⑷同一浓度应采用三管平行操作，且三只平行管的吸光度彼此相差不应超过0.005，若有超过，应去掉其中的异常数后再算平均值，⑸应确定好纵、横坐标轴的分度值，使曲线呈过原点的45°直线，⑹制成的剂量反应曲线的分析范围的浓度上限应能满足95%的临床标本不经稀释便可进行测定，⑺应对作好的剂量反应曲线进行线性关系和线性范围的统计学分析和认证，⑻曲线使用过程中应定期以定值质控血清验证其准确性，⑼更换主要试剂、仪器或检修比计后应重新制备剂量反应曲线，⑽曲线作好、认证后应
标明图线名称，纵横坐标轴及刻度值，制作的实验条件和统计评价数据，以及制作、认证的时间和责任人。
2.干扰因素与排除
⑴黄疸血清、严重溶血、葡萄糖、酚酞及溴磺酞钠对本法有明显干扰，可设标本空白管来消除。具体操作和结果计算如下:
为消除黄疸等因素干扰双缩脲法测定血清总蛋白而设标本空白管(RB)的实验操作表
管 别 加入(ml) | B (空白管) | RB** (标本空白) | S (标准管) | U (测定管) |
1.血清标本（1∶10） | 0.50 | — | — | 0.50 |
2.标准血清（1∶10） | — | — | 0.50 | — |
3. 0.9% NaCl溶液 | — | 0.50 | —心有林希 | — |
4.双缩脲空白试剂* | 4.0 | —阿尼姆斯阿 | — | — |
5.双缩脲试剂 | | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
| | | | |
* 双缩脲空白试剂除不含硫酸铜外，其余成分与双缩脲试剂相同
** 但如标本空白管吸光度太高，可影响测定的准确度。
混匀各管，置25℃30 min或37℃水浴10 min，之后用721分光光度计比，波长540nm，光径1cm，以0.9% NaCl溶液调零，测定各管吸光度。再按下列公式计算标本中的总蛋白
⑵高脂血症血清会干扰比。可采用丙酮沉淀出蛋白质或用乙醚抽提脱脂后再作测定。
⑶属技术性溶血标本应重新采血，属病理、生理性溶血标本只能通过设置标本空白管来消除溶血的干扰。
⑷一些氨基酸和肽类缓冲液，如Tris缓冲液，可产生阳性显反应，不宜采用。
【方法评价】
双缩脲测定蛋白质的方法具有特异性、重复性和精确度较高，在较大浓度（10~140g/L）范围内有良好的直线关系，操作简便，反应快速，95%的临床血浆标本无须稀释即可测定，是当前血浆总蛋白手工测定和自动化分析的首选方法，已被推荐为血浆总蛋白测定的参考方法。可用于盐析和分段盐析产品中的蛋白质定量测定。但宜用作蛋白质含量甚微的其他体液样品和实验样品中的总蛋白定量。
【思考题】
1.双缩脲试剂法测定蛋白质技术特点和意义
2.何谓剂量反应曲线，如何制作，如何检校，使用中须注意什么？
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